综合实验二人乙醛脱氢酶2 ALDH2多态性分析PCR-APLP以及PCR.ppt

* PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 95℃ 第1轮结束 第2轮开始 PCR的特点 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低，血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA PCR的反应体系 Master Mix 0.05 U/μl Taq DNA聚合酶 Reaction buffer 4 mmol/L MgCl2 0.4 mmol/L 各种dNTP 引物　 　 0.2 μmol/L 模板DNA　 0.1～2 μg 引物设计 引物长度以15-30 bp为宜 碱基尽可能随机分布，G+C占40-60% 引物内部避免形成二级结构 两引物间避免有互补序列 模板浓度一般为100 ng/100 ?L，浓度过高会导致反应的非特异性增加，不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白。 引物浓度0.1-0.5 ?mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降 Taq DNA聚合酶0.01-0.05 U/?l，酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量 四种dNTP浓度应相等 Mg2+ 是DNA聚合酶的激活剂，0.5 ～2.5 mmol/L PCR反应条件 基于PCR的扩增产物长度多态性（PCR-APLP） 根据已知DNA片段两端序列设计引物，一端是等位基因特异性引物，另一端是共同引物； 对已知基因 DNA 片段再进行PCR特异扩增； 特异的引物配对可以扩增出某一特异基因型的片段，根据扩增出来的DNA条带大小的差异，可以分析基因型（纯合型、杂合型） ALDH2引物 AL1 5’-TAG GAC ACT CAC AGT TTT CACAT C-3’ (78bp) AL2 5’-CTC TCA CAG TTT TCA CTT T-3’ (73bp) AL3 5’-AAG ATG TCG GGG AGT GG-3’ （共同引物） 5’-CAAATTACTGGGTCAACTGCT-3’ （新共同引物PF ） 每个样品 PCR管1 PCR管2 结论 引物 AL1+PF （140 bp） AL2+PF （135 bp） 条带 有 无 野生型 纯合子基因 条带 无 有 突变型 纯合子基因 条带 有 有 野生型和突变型杂合子基因 综合实验 已经完成 已经完成 琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis 实验原理--琼脂糖凝胶电泳技术 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖，其结构单元是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖。 许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。 其本身不带有电荷，该凝胶适合于免疫复合物、核酸及核蛋白的分离、鉴定及纯化。 核酸凝胶电泳的基本原理 核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移。 同一凝胶中、一定电场强度下在凝胶上可分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。 DNA的迁移速率决定因素 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比。 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快。 DNA的构象 分子：超螺旋环状＞线状＞松弛环状 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比 不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围 浓度（%） 标准 (kb) 高强度(kb) 低熔点(kb) 低黏度低熔点(kb) 0.3 1-50 0.5 0.7--25 0.8 0.5-15 0.8-10 0.8-10 1.0 0.25-12 0.4-8 0.4-8 1.2 0.15-6 0.3-7 0.3-7 1.5 0.08-4 0.2-4 0.2-4 2.0 0.1-3 0.1-3 3.0 0.05-1 0.5-1 4.0 0.1-0.5 6.0 0.01-0.1 电泳缓冲液 TAE、TPE及TBE都是常用电泳缓冲液。三者相比： 1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化； 2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有较高的缓冲容量； 3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%； 4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。 5) 超螺旋DNA在TAE中的