酶与细胞的固定化1专题讲座.ppt

第五章 酶与细胞固定化 (P179) 酶在实际应用中的缺陷 1．酶的稳定性差，容易变性失活； 2．酶在反应系统中与底物和产物混在一起，不便于酶的 回收利用。这不仅使使用酶的成本增加，而且难于连 续化生产； 3．酶反应后成为杂质与产物混在一起，给进一步的分离 纯化带来了一定的困难。 水溶性酶 水不溶性载体 水不溶性酶 （固定化酶） 固定化技术 第一节 酶的固定化 一．固定化酶(immobilized enzyme)的定义 指固定在一定的载体上并在一定的空间范围内进行催 化反应的酶。 二．固定化酶的优缺点 （一）优点 1．极易将固定化酶与底物、产物分开； 2．可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反 应； 3．在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 4．酶反应过程能够加以严格控制； 5．产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6．较游离酶更适合于多酶反应； 7．可以增加产物的收率，提高产物的质量； 8．酶的使用效率提高，成本降低。 （二）缺点 1．固定化时，酶活力有损失； 2．增加了生产的成本，工厂初始投资大； 3．只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对 大分子底物不适宜； 4．与完整细胞相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助 因子的反应； 5．胞内酶必须经过酶的分离手续。 三．固定化酶的制备原则 1．必须注意维持酶的催化活性及专一性； 保护酶的活性中心：尽量保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害。在制备固定化酶时，需要在非常严格的条件下进行，避免用高温、强酸、强碱等处理，而且操作应尽量在非常温和的条件下进行。避免使用有机溶剂、高浓度的盐等使酶变性失活的条件。 保护酶的功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合。 2．固定化应该有利于生产自动化、连续化。为此，用 于固定化的载体必须有一定的机械强度； 3．固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶 与底物的接近，以提高产品的质量； 4．酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收 贮藏，利于反复使用； 5．固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产 物或反应液发生化学反应； 6．固定化酶成本要低，以利工业使用。 四．酶的固定化方法 酶的固定化方法 固定化方法 分类 固定化方法 分类 非共价结合法 结晶法 分散法 物理吸附法 离子键结合法 化学结合法 共价结合法 交联法 包埋法 微囊法 网格法 （一）非共价结合法 1．结晶法：使酶结晶从而实现固定化的方法； 特点：特别适合于活力低的酶的固定。但在不断的重 复循环中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度降低。 2．分散法：通过酶分子分散于水不溶相中从而实现固定 化的方法； 方法：直接将干粉悬浮于溶剂中，并可以通过过滤和 离心的方法将酶进行分离和再利用。 3．物理吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或细胞吸附在 其表面而使其固定化的方法，又简称为吸附法。 常用的吸附剂：活性碳，氧化铝，硅藻土，多孔陶 瓷，多孔玻璃，硅胶，羟基磷灰石等。 特点：操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活或 细胞结构的改变，载体廉价易得且可反复使用。但结 合力较弱，因而使用受限。 硅藻土 羟基磷灰石 活性炭 4．离子键结合法： 载体：某些不溶于水的离子交换剂，如DEAE-纤维 素， TEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶等。 特点：条件温和，操作简便。但结合力较弱，且条件 改变时，易脱落下来。 (二）化学结合法 1．共价键结合法： 载体：纤维素，琼脂糖凝胶，甲壳素等。 过程：首先使载体活化，即借助于某种方法在载体上 引进某一活泼基团。然后这一活泼基团再与酶分子上 的某一基团反应，形成共价键。 特点：结合牢固，酶不会脱落，可连续使用较长时 间，但载体活化的操作复杂，比较麻烦。同时由于共 价结合时可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活 性。 2．交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用 制成网状结构的固定化酶方法。 试剂：戊二醛，己二胺，顺丁烯二酸酐等。 特点： 结合牢固，制得的固定化酶可长时间使用。但交联反应条件剧烈，酶分