多糖的分离纯化.pptVIP

* * * * 近年来，有关莼菜多糖的研究主要集中在生物活性方面， 本实验以碱提醇沉工艺制得莼菜粗多糖，经分离、纯化获得各组分莼菜多糖。。。为进一步研究莼菜多糖的药理活性提供了理论依据。 * * * * * * * * * * * 莼菜多糖的分离纯化 PPT制作：丁楚蔚、汪心妍 汇报人：丁楚蔚 背景资料：谭晓菁、江淑华 研究背景 实验步骤与结果 总结与展望 目录 研究背景 1 莼菜 睡莲科，多年生水生草本植物，又名马蹄草， 有调节免疫、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、降血糖、 降血脂等功效 ， 含酸性多糖、多酚、蛋白质、氨基酸、维生素、组胺及微量元素， 多糖在莼菜干品中所占的比例最高，主要分布于叶底部、茎周围的黏液质中，是莼菜发挥药效的主要物质基础。 方法流程 采用碱提醇沉工艺，经除蛋白、除色素得到莼菜多糖 (BSP) 再经DEAE纤维素DE-52柱Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对BSP进行分级精制 采用高效凝胶过滤色谱 (HPGFC)测定BSP各组分的分子量 仪器与材料 Agilent 1200 HPLC 色谱仪 AE240 分析天平 UV-2102PC 紫外可见分光光度计 FD-1C-55 冻干机 旋转蒸发仪 超滤仪 DZG-6020 减压干燥箱 莼菜嫩叶；无水乙醇； NaOH；盐酸；木瓜蛋白酶；聚酰胺树脂； DEAE 纤维素 DE-52；琼脂糖凝胶 Sepharose CL-6B； 透析袋；蒽酮、硫酸；纯化水 粗多糖的提取 莼菜粗多糖 加40倍 0. 3 mol/L NaOH 溶液，70 ℃ 加热搅拌提取 2 h，加盐酸中和，过滤，滤液浓缩，加入无水乙醇至 67% ，4 ℃静置过夜，4 500 r/min 离心 20 min，80% 乙醇洗涤 3 次，沉淀减压干燥，得 83 g 莼菜粗多糖。 除去脂溶性成分 取250g莼菜喷干粉，加无水乙醇2.5 L，60 ℃ 旋转回流提取2 h，过滤，重复操作 1 次，除去脂溶性成分，滤渣烘干。 莼菜喷干粉 新鲜莼菜嫩叶，经清水淋洗、均浆机剪切、喷雾干燥得莼菜喷干粉 。 粗多糖纯化 01 02 03 04 酶解灭活脱蛋白 粗多糖用 2.5 L 纯化水复溶，加入木瓜蛋白酶，63 ℃ 酶解 6 h，灭活过滤除去不溶物，滤液进行第2 次酶解灭活脱蛋白。 聚酰胺层析 滤液流经预处理的聚酰胺层析柱脱色，滤液与聚酰胺湿填料的体积之比为1∶1，纯化水洗脱，共收集洗脱液 8 L。 滤膜过滤浓缩 再用微孔滤膜过滤，滤液用超滤膜超滤浓缩至800mL 后加入无水乙醇至67%，4 ℃ 静置过夜后离心，80% 乙醇洗涤 3 次，减压干燥。 得到BSP 获得灰白色胶状莼菜多糖 (BSP) 22 g，收率为 8. 8% 。 BSP含有量测定 01 02 03 葡萄糖标准曲线制作 BSP纯度测定 精密称取干燥至恒重的BSP 24.72 mg 至 500mL 量瓶，纯化水溶解并定容，摇匀，测定样品吸光度为 0.521，计算可知 BSP的纯度为 61. 89% 。 紫外检测 粗多糖经木瓜蛋白酶脱蛋白、聚酰胺脱色素等处理后，紫外全波长扫描显示在 260、280 nm 处其吸光度接近于零，表明已除去蛋白质、核酸等杂质。 利用蒽酮硫酸法： 以葡萄糖质量浓度为横坐标 (X)，吸光度为纵坐标 (A)得曲线方程 A = 17. 294X －0. 0076 (Ｒ2 = 0. 9994)。 BSP 精制 取10 g BSP，200 mL 纯化水充分溶解后过DEDA 纤维素 DE-52 离子交换柱 (60 mm × 950 mm)，依次用0～1.0mol/L NaCl 溶液梯度洗脱，分管收集洗脱液，采用 “2. 2” 项下方法，以洗脱管数为横坐标，多糖浓度为纵坐标绘制洗脱曲线。 BSP 经 DEAE 纤维素 DE-52 分离后，可得 3 个峰 (图 1)，透析 (截留分子量 8 000 ～ 14 000)、浓缩、冻干各峰组分，得到 BSP-1、BSP-2、BSP-3。 * * * * 近年来，有关莼菜多糖的研究主要集中在生物活性方面， 本实验以碱提醇沉工艺制得莼菜粗多糖，经分离、纯化获得各组分莼菜多糖。。。为进一步研究莼菜多糖的药理活性提供了理论依据。 * * * * * * * * * * *