食品中铜绿假单胞菌检测（2）.pptVIP

包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测 主要内容 选题背景 铜绿假单胞菌的致病性 铜绿假单胞菌的检测 一、选题背景 2014年新出台的食品安全国家标准 GB19298-2014《包装饮用水》 的微生物指标中： 删除了菌落总数指标； 保留了大肠菌群； 增加了铜绿假单胞菌这一指标 。 国内外包装饮用水污染情况 国内污染情况： -瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.2％～23.6％； -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6％。 国外污染情况： -Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单胞菌； -Rosenberg报告德国1.2％～10.2％的瓶装矿泉水检出铜 绿假单胞菌。 国家标准要求：0 CFU/250ml（不得检出） WHO在HACCP的评估中明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹泻。 尤其是抵抗力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜绿假单胞菌的瓶装水很可能导致疾病的发生。 普通人食入103~104个菌体细胞即可被侵害。 假单胞菌属包括200余种菌。 多数为腐生菌，少数为植物和动物寄生菌，大多为条件致病菌。 假单胞菌属分布广泛，土壤、水和空气中均有存在。人类非发酵菌感染中，假单胞菌占70％～ 80％，主要为铜绿假单胞菌。 铜绿假单胞菌也是医院感染的主要病原菌。 假单胞菌属致病检出率 二、铜绿假单胞菌的致病性 主要致病物质是内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、胞外酶和外毒素等多种致病因子。 可引起局部化脓性炎症，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内膜炎 、脓胸，还可引起败血症及婴儿流行性腹泻。 本菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。 经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。 铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）俗称绿脓杆菌，因为在代谢过程中产生水溶性的绿色色素，皮肤有伤口时易感染，使伤口与创面呈绿色，故名绿脓杆菌。 铜绿假单胞菌的菌体形态 无芽孢，无夹膜，革兰氏染色后为红色，革兰阴性杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，运动活泼。菌体的大小为0.5～1μm×1.5～3.0μm，菌体笔直或弯曲。 三、铜绿假单胞菌的检测 （一）检测方法（滤膜法） （二）检测原理 （三）试剂和设备 （四）检测步骤 （五）报告 （一） 铜绿假单胞菌检测方法（滤膜法）  GB/T 8538-2008 饮用天然矿泉水检验方法 （二）检测原理 铜绿假单胞菌的特性： 需氧菌，营养要求不高，产色素(主要为绿脓素) 90 ％以上的菌株产生蓝绿色色素。 98 ％菌株产生水溶性荧光色素。 氧化酶试验呈阳性。 分解乙酰胺产生氨。 将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤， 并将滤膜移至CN琼脂选择性培养基上，于36℃士 1℃恒温箱中培养48h，典型菌落能够在CN琼脂选择 性培养基上生长并产生绿脓菌素，或者能够在CN琼 脂选择性培养基上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光 （360±20nm）照射下能产生荧光、能够利用乙酰 胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假 单胞菌，则其检测结果为阳性。 （三）试剂和设备 ? 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂 ? 营养琼脂 ? 金氏B 培养基 ? 乙酰胺肉汤 ? 氧化酶试剂 ? 钠氏试剂 1、检测试剂 1、检测试剂 2、检测材料 2、检测材料 3、 设备和仪器 玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121℃高压蒸汽灭菌15min 恒温培养箱：36℃±1℃ 紫外灯：波长应为360±20nm 滤膜：直径47mm，微孔径为0.45μｍ 显微镜：10×～100× 冰箱：0℃～8℃ （四）检测步骤 检验程序 水样过滤 培养 结果观察 确证性试验 计数 结果说明 2、水样过滤 在100级的洁净工作台进行过滤操作。 首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分， 将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上， 固定好滤器，将250mL水样或稀释液通 过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤 后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上， 平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着 气泡。 3.培养 将平板置于36℃士 1℃恒温箱中培养48h， 并防止干燥。 4、结果观察 培养20h～24h观察滤膜上菌落的生长 情况并计数，防止因为培养导致菌落过分 生长而出现菌落融合。（ 40h～48h时更 容易观察产色素情况和荧光情况）。 A