DBS13008-2017食品安全地方标准肉及肉制品中沙门氏菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法.pdfVIP

DBS13 河 北 省 地 方 标 准 DBS13/008—2017 食品安全地方标准 肉及肉制品中沙门氏菌环介导等温扩增 （LAMP）检测方法 2017-11-08发布 2018-02-01实施 河北省卫生和计划生育委员会 发布 DBS13/008—2017 食品安全地方标准 肉及肉制品中沙门氏菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法 1 范围 本标准规定了肉及肉制品中沙门氏菌环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification ，LAMP）检测方法。 本标准适用于肉及肉制品中沙门氏菌的快速筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检测 总则 GB4789.4 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB/T 82 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 原理 根据沙门氏菌属特有的靶序列invA基因设计的两对特殊的内、外引物和一对环引物，特异性 识别靶序列上的六个独立区域，利用BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）启动循环链置换反应， 在invA基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎- 环DNA混合物；加入SYBRGreenI染料，即可通过颜色变化观察判定结果。 叠氮溴化丙锭(propidiummonoazide，PMA)染料能够嵌入细胞外DNA或者穿过非活性菌受损 的细胞膜进入细胞进而嵌入其DNA 内，但被阻隔在活性菌的完整细胞膜之外。嵌入非活性菌DNA 的PMA染料能够在强光照射下通过叠氮基团与DNA进一步形成牢固的共价结合，使其不能在后 续的LAMP反应中扩增，因而可在LAMP反应中消除来自于非活性菌的DNA对LAMP检测结果 的影响。 4 仪器和设备 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 4.1 冰箱：2 ℃～5℃，-20℃； 4.2 恒温培养箱：3 ℃±1℃，42 ℃±1℃； 4.3 均质器； 4.4 振荡器； 4.5 电子天平：感量 0.1g； 4.6 二级生物安全柜； 4.7 高速台式离心机：5000r/min~1 000r/min； 4.8 水浴锅或加热模块： 3℃±1℃，80℃±1℃； 4.9 微量移液器（0.1μL~2.5μL；0.5μL~10μL；20μL~200μL；100μL~1000μL）和吸头； 2 DBS13/008—2017 4.10 无菌透明离心管：1.5mL； 4.11 PCR反应管 （透明）； 4.12 水浴振荡器：220r/min，37℃±1℃； 4.13 卤素灯：500W 。 5 试剂和材料 除有特殊说明外，实验所用试剂均为分析纯或符合生化试剂标准；实验用水应符合 GB/T 82 中一级水的要求。 5.1 缓冲蛋白胨水（BPW），见GB4789.4中A.1。 5.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液，见GB4789.4中A.2。 5.3 亚硒酸胱氨酸（SC）增菌液，见GB4789.4中A.3。