液相色谱实用技术_色谱柱的使用及保养.pptVIP

液相色谱实用技术 色谱柱的使用及保养 良好的色谱实验习惯 拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件 定期检测柱效 定期检测仪器的谱带展宽 色谱柱的使用及操作 流动相的转换 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求 色谱柱的保养（一） 样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用 色谱柱的保养（二） 流动相方面 除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯， 溶剂中的杂质含量 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例 在线的保护装置 给色谱柱提供物理的保护 除去样品及流动相中的颗粒 给色谱柱提供化学的保护 防止分析柱被化学污染 装置 在线过滤器 自装填料保护柱 预装保护柱 在线过滤器 In-Line Filter 防止颗粒在色谱柱头累积 优点：基本不影响柱效 在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析） 可更换的消耗品 更换滤芯， 更换垫圈， 保护柱 可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时 保护柱的种类 普通自装填料的保护柱 用户自装填料 影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大 色谱柱的清洗 对所做的样品要有充分的了解 用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗 硅胶柱的一般方法 先用甲醇洗去极性杂质 用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化 键合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗 色谱柱的存放 存放前的处理 除去杂质、盐  合适的存放溶剂 避免色谱柱床的干枯 避免机械震动 防止细菌生长 色谱柱常见毛病 柱压过高 多少才算高? 不同色谱柱有差异 不同系统有差异 不同溶剂有差异 柱效低 重复性差 不出峰，回收率低 柱压过高 为什么柱压会过高 微粒堵塞 样品 流动相 密封垫 柱床膨胀 不可逆吸附 细菌生长 柱效低 为什么柱效低 色谱柱被污染 过滤片部分堵塞 样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞 色谱柱内的死体积 流动相pH值及组成不合适造成固定相流失 流速急剧变化造成固定相物理损坏 机械震动造成固定相产生裂缝 柱床收缩或干枯 重复性差、回收率低 实验的重复性差 色谱柱被污染 流动相pH值及组成不合适造成键合相流失 样品溶剂不同或样品本身不稳定 回收率低，不出峰 “不可逆”吸附 固定相过强或流动相过弱 非特异性吸附 色谱柱以外的因素（一） “柱效”问题，不一定是色谱柱问题！ 仪器问题：连接不好造成死体积 进样器 检测器 管路，连接口 保护柱 在线过滤器堵塞 流动相问题：色谱柱未平衡好 进样量太大 色谱柱与仪器的联接 除HP外，不同公司产品，其接头不同。处理不当时，会造成： 色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏 解决办法： 自制相应的转换接头 使用“通用”型接头（锥箍及螺母） 这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。从Phase Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接头，可用在所有类型的色谱柱上的。 Waters色谱柱的联接 Waters及Phase Separations锥箍及螺母相同，但锥箍前露出不锈钢管长度不同，其长度被称为：“stop-depth” Waters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用的是“Waters”标准，其stop-depth的长度为0.130英寸 Spherisorb品牌的色谱柱及Phase Separations公司其他品牌色谱柱用的是“Parker-style”标准，其 stop-depth 为0.090英寸 不同的Stop-Depth长度 色谱柱以外的因素（二） 柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！ 系统反压问题 阻尼器堵塞 进样器堵塞 管路或连接口堵塞 在线过滤器不干净 保护柱 压力传感器不准确 流速是否错误? 色谱柱以外的因素（三） 实验的重复性差 梯度实验时平衡时间不足 温度波动 流动相组成改变 样品溶剂不同 样品稳定性不好 方法的开发不好 缓冲液的pH值不合适 缓冲液的缓冲能力不足 液相色谱实用技术（二） 流动相及样品的预处理 液相色谱对流动相的要求 除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶ 与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 细菌的生长 流动相的脱气 流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化 流动相脱气的方法