遗传病的基因诊断PPT幻灯片.pptVIP

（一）血红蛋白病概述 血红蛋白由四条链组成，两条α链和两条β链，每一条链有一个包含一个铁原子的环状血红素。 * * 血红蛋白病（hemoglobinopathy）是由于血红蛋白分子结构异常（异常血红蛋白病），或珠蛋白肽链合成速率异常（珠蛋白生成障碍性贫血，又称海洋性贫血）所引起的一组遗传性血液病。临床可表现溶血性贫血、高铁血红蛋白血症或因血红蛋白氧亲和力增高或减低而引起组织缺氧或代偿性红细胞增多所致紫绀。 * （二）血红蛋白病的分类 异常血红蛋白病：Hb结构发生了变化 导致贫血病 如：镰刀状细胞贫血 地中海贫血：组成Hb的珠蛋白很成降低 或消失，Hb的结构不发生 变化 亦称：珠蛋白合成障碍性贫血 * （三）镰状细胞贫血 红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫血。 患者多在成年以前死亡 * × MstⅡ酶切位点(CCTNAGG) 5′ 3′ 正常基因 5′ 3′ 突变基因 1.15kb 1.35kb 1、镰状红细胞贫血分子机制 5 6 7 --Pro Glu Glu— --CCT GAG GAG-- 5 6 7 --Pro Ala Glu— --CCT GTG GAG-- * 2.镰状细胞贫血的基因诊断方法 常用方法有限制性内切法（RE），ASO，ARMS，跨越断裂点的PCR技术（裂口-PCR） 最常用的是RE * 限制性内切酶/Southern blot 采集制备血液DNA→内切酶MstⅡ消化→电泳→转膜→32P标记的β珠蛋白cDNA杂交→放射自显影 * * + ﹣ 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人 突变携带着 患者 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 * PCR/限制性内切酶 设计引物→PCR扩增→产物进行限制性内切酶酶切→电泳→EB染色→直接观察 例： 引物1：5’-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3’ 引物2：5’-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3’ 扩增产物294bp * 引物1 CCT GAG GAG CCT GTG GAG 引物1 引物2 引物2 294bp 103bp 191bp MstⅡ酶切位点(CCTNAGG) * + ﹣ 103bp 191bp 294bp 正常人 突变携带着 患者 镰状红细胞贫血患者PCR产物的限制性酶切分析 * （四）、β－地中海贫血(β－Thalassaemia,简写βthal或βT) β珠蛋白基因突变导致该多肽链的合成大为减少（β＋）或完全缺失（β0） β珠蛋白合成速率降低，导致β链和α链合成的不平衡→多余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上→改变了膜的通透性和硬度→导致溶血性贫血。 高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。 缺乏有效治疗措施。 * 1、 β地贫病的分子基础 β珠蛋白基因全长2053bp，含2个内含子（IVS－I和IVS-II），3个外显子。 目前发现突变有百余种，中国人群发现约20种； 一般对特定种族来说，90%的β地贫基因仅由4～6种突变组成。 * 2、 β地中海贫血的基因诊断 PCR/ASO斑点杂交法 合成2对PCR引物（扩增区段700bp和580bp，分别包含14种和1种可能突变）→合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（4～6对，分别标记） →制备DNA样品 →PCR扩增 →斑点印迹杂交 RFLP分析法 * a c 左侧缺失4.2kb 右侧缺失3.7kb b b b a α2 α1 α1 α2N端α1C端 正常基因序列 PCR扩增法——定性分析 左侧缺失型基因序列 右侧缺失型基因序列 ac扩增0.4kb ab无扩增片段 ab扩增1.2kb * + ﹣ 0.4kb 1.2kb 正常人 右侧缺 失患者 地中海贫血患者基因组的PCR分析 左侧缺失患者 * Thank you！ * 为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如Minifold I和II、Bio-Dot (Bio –Rad )和Hybri –Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状， 遗传病的基因诊断 药学2班 辛鑫 * 一、基因诊断的概念 及常用技术 *