2019年重组门冬酰胺酶制备表达纯化.pptVIP

酶类药物 -- 重组门冬酰胺酶Ⅱ表 达和制备 酶的分类 酶 单纯蛋白质（多种氨基酸组成） 结合蛋白质 酶蛋白（蛋白部分） 辅酶或辅基 （非蛋白部分） 金属：如 Cu 2 ＋ 、 Mn 2 ＋ 金属有机物：如铁朴啉 不含金属的有机物 如：烟酰胺、 VB2 等的衍生物 酶 胞外酶 胞内酶 游离酶 结合酶 酶类药物：依照其功效和临床应用分类 1. 消 化酶类 胰酶、胰脂酶、胃蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等 2. 消 炎（抗炎） 、粘痰溶解酶类 胰蛋白酶、糜蛋白酶、糜胰蛋白酶、胶原酶、 SOD 、菠萝 蛋白酶、溶菌酶、玻璃酸酶、 DNase 3. 循环酶类 抗凝酶：链激酶、尿激酶、纤溶酶 止血酶：人凝血酶、蛇毒凝血酶、促凝血酶原激酶 血管活性酶：激肽释放酶、弹性蛋白酶 4. 抗 肿瘤酶 门冬酰胺酶、谷氨酰胺酶 5. 其 它生理活性酶 青霉素酶、尿酸酶、细胞色素 C 门冬酰胺酶Ⅱ L - 天门冬酰胺酶 AnsB 能催化天门冬酰胺水解 生成天冬氨酸和氨。淋巴瘤和白血病细胞通常 不能合成天门冬酸胺， L - 天门冬酸胺酶将阻 止癌细胞蛋白质合成而导致癌细胞死亡。在临 床上， L - 天门冬酰胺酶已广泛用于治疗白血 病和淋巴瘤。但目前国内尚不能生产，国外也 仅有低产酶能力的大肠杆菌野生株产品，生产 成本高，药价昂贵。基因工程菌产品既能填补 国内空白，又能大幅度降低生产成本。 参 考 文 献 1--- 重组与表达 刘景晶，李晶，吴梧桐，胡梅清 . 《大肠 杆菌 L- 天门冬酰胺酶Ⅱ基因的高效表达 》 中国药科大学生物化学教研室 , 南京 210009 南京铁道医学院生物化学教研室 , 南京 210009 2--- 提取与纯化 刘景晶 , 金健勤 , 戴海滨 , 吴梧桐 . 《大肠杆菌 L 门冬酸胺酶的提取和纯化》中国药科大 学生化教研室 , 南京 210009 重组与表达 材料 限制酶 Ncol 、 Hind III 及 T 4 DNA 连接酶， 购自 Promega 公司； Taq 酶、 dNTP 、 IPTG 购自华美公司；丙烯酰胺、 N , N - 甲 叉双丙烯酰胺、 SDS 购自 sigma 公司。 pKK 233 -2 购自 clonetech 公司； pKK 233 - ansB 是将代 PCR 扩增得到的 AnsB 基因 DNA 用 Ncol 和 Hind III 消化后，定向插 入 pKK 233 -2 的多克隆位点而得到的重组 质粒。 实 验 方 法 PCR 扩增 AnsB 基因 重组质粒 PKK233-ansB 的构建 阳性转化子的筛选 PCR 扩增 AnsB 基因 ? 模板的制备：用接种环挑取 CPU 210009 菌体少许，在裂解液 (1 ﹪ TritonX-100,2mmol/LTris-HCl pH8.5 ,2mmol/L EDTA)1ml 中振散， 95C 加热处理液 10min, 吸取处理液 5ul 用于 PCR 。 引物： E1: 5 ‘ -GGCCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCACITGC 一 3′ E2: 5′ -GGAAGCTTGAGAATGCCGTGATAC 一 3 ′ 11 ： 5′ -GGCCATGGAGT111TCAAAAAGACGCACTTGC 一 3′ 12 : 5′ -GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG 一 3 ′ 扩增条件： 84C 变性 1 min ; 60C 复性 2 min ; 72C 延伸 1 min ；循环 28 次。 重组质粒 PKK233-ansB 的构建 ? PcR 扩增后的 DNA 片段及质粒 pKK 233 -2 同 时分别用限制酶 Ncol 和 Hindl 消化并用琼脂搪 凝胶电泳分离和回收质粒大片段；将消化后的 DNA 片段和电泳回收的质粒大片段用 T 4.DNA 连接酶连接，连接产物经琼脂糖凝胶 电泳回收后转化 HB 1 01 、 71 / 15 、 ATCc 9637 、 JM107 、 cPU 2