11.4生物制品分析方法 -免疫法.pdf

生物制品分析的常用方法 生物制品分析中常用的方法包括理化分析法、电泳法、酶法、免疫法、生物检定法等。 理化分析法在前面章节已有介绍，本节主要介绍电泳法、酶法和免疫法。 三、免疫分析法 动物的免疫反应分为细胞免疫和体液免疫两种。体液免疫指在外界抗原物质的刺激下产 生专一性抗体的反应。抗原和抗体的沉淀反应可以在体外发生，目前常被用于抗原物质的鉴 定。免疫扩散和免疫电泳法因其高度的反应专一性而成为近代生物制品不可缺少的分析技术。 常用的方法包括：免疫斑点法、免疫印迹法、免疫双扩散法和免疫电泳法。 免疫分析法（immunoassay ，IA ） 是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。由于免 疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、 生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。各种标记技术（放射性标记、荧光标记、化学发 光、酶标记等）的发展，使免疫分析的选择性更加突出。结合免疫分析法与其他分析方法的 放射免疫测定法和酶联免疫测定法因具有独特的优势，随着商品化试剂盒的普及，近年来在 定量分析中的应用也越来越广泛。 （一）免疫鉴定法 1. 免疫斑点法 本法系以供试品与特异性抗体结合后，抗体再与酶标抗体性能特异性结合，通过酶学反 应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。 检查方法是取硝酸纤维素膜，用EBM 缓冲液浸泡15 min，将供试品、阴性对照品（可 用等量的人白蛋白）及阳性对照品点在膜上，上样量应大于 10ng。室温干燥 60min 。取硝 酸纤维素膜，浸入封闭液（10%小牛血清的TTBS 缓冲液，或其他适宜的缓冲液）封闭60 min 。 弃去液体。加入缓冲液 10ml，摇动加入适量的供试品抗体（参照抗体使用说明书的稀释度 稀释），室温过夜。硝酸纤维素膜用TTBS 缓冲液淋洗1 次，再用TTBS 缓冲液浸洗3 次， 每次8 min。弃去液体，更换TTBS 缓冲液10ml，摇动加入适量的生物素标记的第二抗体， 室温放置40 min 。硝酸纤维素膜用TTBS 缓冲液淋洗1 次，再用TTBS 缓冲液浸洗3 次，每 次8 min。弃去液体，更换TTBS 缓冲液10ml，摇动加入适量的亲和素溶液和生物素标记的 辣根或氧化物酶溶液，室温放置60 min 。硝酸纤维素膜用TTBS 缓冲液淋洗1 次，再用TTBS 缓冲液浸洗4 次，每次8 min。弃去液体，加入适量底物缓冲液，置于室温避光条件下显色， 显色程度适当时水洗终止反应。 结果判定 阳性结果呈现明显色带。阴性结果不显色。 2.免疫印迹法 本法系以供试品（抗原）与特异性抗体结合后，抗体与酶标抗体特异性结合，通过酶学 反应的显色，对供试品抗原特异性进行检查。 检查法 照 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行电泳，供试品与阳性对照品上样量应大于 100ng。取出凝胶，切去凝胶边缘，浸于EBM 缓冲液中30min 。另取与凝胶同样大小的厚滤 纸6 张、硝酸纤维素膜1 张，用EBM 缓冲液浸透。用半干胶转移仪进行转移：在电极板上 依次放上湿滤纸3 张、硝酸纤维滤膜1 张、电泳凝胶、湿滤纸3 张，盖上电极板，按0.8 mA/cm²硝酸纤维素膜衡电流转移45 min 。 取出硝酸纤维素膜进入封闭液（10%小牛血清的TTBS 缓冲液，或者其他封闭液）封闭 60 min 。弃去液体。加入TTBS 缓冲液 10ml，摇动加入适量的供试品抗体 （参考抗体使用 说明书的稀释度稀释），室温过夜。硝酸纤维素膜用 TTBS 缓冲液淋洗 1 次，再用 TTBS 缓冲液浸洗3 次，每次8 min。弃去液体。再加入TTBS 缓冲液10ml，摇动加入适量的生物 素标记的第二抗体，室温放置40 min 。硝酸纤维素膜用TTBS 缓冲液淋洗1 次，再次TTBS 缓冲液浸洗3 次，每次8 min。弃去液体，更换TTBS 缓冲液10ml，摇动，加入适量的亲和 素溶液和生物素标记的辣根过氧化物酶溶液，室温放置60min 。硝酸纤维素膜用TTBS 缓冲 液淋洗1 次，再用TTBS 缓冲液洗4 次，每次8 min。弃去液体，加入适量底物缓冲液，置 于室温避光条件下显色，显色程度适当时水洗终止反应，其示意图见1。 结果判定 阳性结果呈现明显色带。阴性结果不显色。 图1、免疫印迹法示意图 3. 免疫双扩散法 本法系在琼脂板上按一