8.4体内样本前处理-2.pdf

体内样品前处理--固相萃取法及其他方法 由于高效液相色谱，尤其是反相高效液相色谱的成功应用，启示人们利用色谱理论，采 用装有不同填料的小柱进行体内样品的预处理，而发展了固相萃取（solid-phase extraction ， SPE）技术。SPE 技术亦称液--固萃取技术，它的应用大大缩短了样品处理时间，同时可避 免乳化现象，而且便于自动化操作。 一、固相萃取法 （solid-phase extraction，SPE） （一）SPE 原理 将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的体内样品溶液通过小柱时，由于受 到 “吸附”、“分配”、“离子交换”或其他亲和力作用，药物及内源性物质同时被保留在 固定相（填料）上，用适当溶剂洗除干扰物质，再用适当溶剂洗脱药物。 药物的洗脱方式有两种：①一种是药物比干扰物质与固定相之间的亲和力更强，因而在 用冲洗溶剂洗去干扰物质时药物被保留，然后用一种对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物；② 是干扰物质较药物与固定相之间的亲和力更强，则药物被直接洗脱，干扰物质被保留在萃取 柱上，使用较多的是前一种洗脱模式。 SPE 的填料种类繁多，可分成亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合硅胶）、亲水型（硅胶、 硅藻土、棉纤维）和离子交换型三类，其中亲脂型用得最多。烷基、苯基、氰基键合硅胶都 可用作固相萃取吸附剂，其中十八烷基硅烷键合硅胶（ODS 或C18 ）最常用。亲脂性键合硅 胶容易吸附水中的非极性物质，易用有机溶剂洗脱，适用于萃取、净化水基质体液中疏水性 药物。常见的商品SPE 柱有Sep-Pak C18、Bond-Elut C18、CN （氰基）、C2 （乙基）、Ph （苯 基）Baker 10 C18 等。 （二）SPE 操作步骤 使用亲脂性键合相硅胶SPE 柱的一般操作步骤如下。 1、活化 用甲醇润湿小柱，活化填料，以使固相表面易于和待测组分发生分子间相互 作用，同时可以除去填料中可能存在的干扰物质。 2 、溶剂交换（平衡） 用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除过多的甲醇，但冲洗不宜 过分。否则会使甲醇含量过低（低于5%），导致C18 链弯曲折叠，对待测物的吸附能力下降， 造成萃取回收率降低。 3、加样 使体内样品通过小柱，并弃去滤过废液。 4 、淋洗 用水或适当缓冲液冲洗小柱，去除吸附于固定相上的内源性物质或其他相关 干扰物质。 5、洗脱 选择适当的洗脱溶剂洗脱待测物，收集洗脱液，挥干溶剂备用或直接进行在 线分析。 使用亲脂性键合硅胶 SPE 柱时，需注意：①体液样品（如血浆等）通过萃取柱的流速 控制在1~2ml/min 。②冲洗液和洗脱剂的强度、用量要适当，否则会导致药物的损失或洗脱 选择性下降。通常选用可与水混溶的洗脱剂。③萃取碱性药物时，洗脱剂中常需加酸、有机 胺或氨水、醋酸铵或离子对试剂。 对于大量样品的处理，则有赖于半自动化和全自动化的仪器。半自动SPE 是指萃取过程 机械化，但将洗脱液转移至进样器则需要手工操作。全自动化仪器是通过柱切换技术实现的， 利用切换阀使固相萃取小柱直接联入流路中。 二、超滤法 超滤法（ultrafiltration ）是以多孔性半透膜（超滤膜）作为分离介质的一种膜分离技术。 通过选用不同孔径的不对称性微孔膜、按照截留分子量的大小，可分离30 ~1000 kD 的可溶 性生物大分子物质。与通常的分离方法相比，超滤具有不引入化学试剂，没有相态变化，对 待测药物的破坏性小等优点。 2 血液中游离药物的测定可采用分子量截留值在 5 万左右的超滤膜，用加压（2 kg/cm ） 过滤法或用高速离心法将血浆或血清中游离型药物与分子量大的血浆蛋白以及结合了药物 的血浆蛋白分离，从超滤液或离心液中得到游离型药物，然后可直接或经浓缩后测定其浓度。 三、缀合物水解 药物或其代谢物与体内的内源性物质结合生成的产物称为缀合物（conjugate ）。内源性 物质有葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸等，特别是前两种为最重要的内源性物 质。一些含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷 缀合物；还有一些含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。尿中药 物多数呈