2011细胞生物学技术.ppt

许多动物： 雌性一次产多个卵 （处于同一时期） 例 2 受精 受精卵 同步卵裂 同步化细胞群体 集落抑制率与药物剂量间的关系 细胞集落形成 —— 实验范例 （平板克隆形成实验、软琼脂集落形成实验） 实验用品： （平板克隆形成实验） ? 材料： HeLa 细胞 ? 试剂： 1640 培养液、胎牛血清、 0.25% 胰蛋白 酶、吉姆萨染液。 ? 设备：细胞计数板、 60mm 培养皿、 10ml 移 液管、小烧杯、 10ml 吸管橡皮头、超净 工作台、培养箱、倒置显微镜、离心机、 水浴锅。 实验步骤： 200 个 / ml ，接种于 24 孔板， 4 个平行孔，每孔加入 1 ml （ 950μ l 细胞悬液 50μ l 药液） 培 养 （ 2~3 周， 肉眼可见克隆） （甲醇：冰醋酸 ＝ 3 ： 1 ） 计 算 第一节 细胞生长增殖研究技术 二、细胞周期分析技术 细胞同步化实验 流式细胞仪检测细胞周期 通过分析 CDK 的活性检测细胞周期 一、细胞增殖生长力（判定细胞活力） 细胞计数 细胞分裂指数 细胞集落形成实验 3 H-TdR 渗入法 ( 氚标记胸腺嘧啶核苷 ) MTT 检测细胞生长状况 （四） 3 H-TdR 渗入法（氚标记胸腺嘧啶核苷） —— DNA 合成速度 意义：反映细胞增殖水平 动态观察细胞复制分裂情况， 确定细胞周期各期时间 原理： 3 H-TdR 能特异掺入 DNA 合成（ S 期），使新合成的 DNA 带核放射性， 掺入量和合成 DNA 的速度正相关。 interphase 2N DNA 4N DNA 4N DNA 2N DNA 3 H-TdR 渗入法 实验用品 ? 材料 贴壁培养的细胞 ? 器材 液闪计数器（液体闪烁计数器 ）。 ? 试剂 标记物 5μ Ci[methyl- 3 H]-TdR/ml （ 5 微居里甲基氚标记胸腺嘧啶核苷 / 毫升），用 培养液配成、 PBS 、 0.25% 胰蛋白酶和 0.02íTA 混合消化液。 ? 实验步骤 24h~48h 12h ~ 24h 加 含 培 养 液 弃 原 培 养 液 3 H-TdR 清 洗 PBS 消 化 收 集 细 胞 提 取 DNA 滤 出 DNA 放射性脉冲数 /min 烘 干 结果分析 被标记的为 S 期细胞 3 H-TdR 渗入量反映 DNA 含量 （ 2 × 10 4 -5 × l0 4 个 /ml 24 孔培养板） （液闪计数器） 肿瘤研究上有重要意义： ? 筛选抗肿瘤药物种类 ? 确定剂量，用药时间 ? 制定化疗方案 ? 判定疗效预后 ? 研究干预因素 3 H-TdR 渗入法（氚标记胸腺嘧啶核苷） ? 直接计数法 —— 工作量大 ? 3H-TdR 渗入法 —— 具有放射性 限制应用 1983 年 Mosmann 提出： —— MTT 检测细胞生长状况 优点： ? 灵敏性高 ? 重复性好 ? 操作简便 ? 经济安全 广泛应用 MTT 法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比 色法）。 ? MTT 是一种噻唑盐，化学名 3- （ 4 ， 5- 二甲基 -2- 噻唑） -2 ， 5- 二苯基四氮唑 溴盐，商品名为噻唑盐。水溶液为黄 橙色。 （五） MTT 检测细胞生长状况 ? 原理： + 活 细 胞 死 细 胞 MTT 线粒体 琥珀酸 脱氢酶 难溶性的 蓝紫色结晶物 --- 甲臜 ( 沉积细胞中 ) 外 源 的 + 二甲基亚砜 （ DMSO ） 甲臜溶解 + 酶标仪 光吸收值 （ OD 值） 490nm 此酶消失 不形成甲臜 ※ 可间接反应活细胞数量：在一定细胞数范围内， MTT 结晶物形成与活细胞数成正比， OD 值与活 细胞数目成正比。 MTT 法 —— 实验范例 实验用品： ? 材料： HeLa 细胞 ? 试剂： 1640 培养液、胎牛血清、 0.25 胰蛋白 酶、二甲基亚砜、 MTT 溶液。 ? 设备： 96 孔板、 10ml 移液管、小烧杯、 10ml 吸 管橡皮头、超净工作台、培养箱、倒置 显微镜、离心机、水浴锅、混合振荡器、 酶联免疫检测仪。 （ 96 孔板， 200μ l/ 孔 1000~10000 个 / 孔） 培 养 （ 3~5d ） MTT 20μ l 孵育 4h 弃上清 150μ l DMSO 振荡 10min OD 普通 MTT 法实验步骤 （ 4000 较好） 以时间为横坐标，以细胞数目或 OD 值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。 注意事项： ? 血清会干扰 OD 值，所以在显色后尽可 能将孔内残余培养基吸净。 ? 设空白对照：不加细胞仅加培养基的空 白对照孔，其他实验步骤保持一致。比 色时，以空白孔调零。 应用： 抗癌药物研究 —— 通过比较对照与 处理组间细胞的存活率，可以判断 抗癌药物的作用强度。 细胞增