第二章蛋白质组研究方法.pptVIP

4 、高通量和自动化 2-DE, 染色，图像分析 胶上蛋白点自动切割，置于 96 孔或 384 孔板 自动蛋白酶解，多肽回收，点样与 MS 样品靶 自动 MS 样品分析 自动收集数据，数据库检索，蛋白鉴定 ? 分子扫描 2 － DE 电泳胶 固相化胰蛋白酶 的 PVDF 膜 PVDF 膜 ＋ ＋ 肽质量指纹分析 5 、 2-DE 的局限性 （ 1 ）实验设计 ? 样本间的异质性 ? 组织中多种细胞并存 ? 可采用激光捕获显微切割的方法（ laser-capture microdissection,LCM ）获得单纯细胞 （ 2 ）重复性 ? 对 2-DE 的条件进行优化 ? 样品的获得和预处理过程 （ 3 ）动态范围 ? 有限的动态范围 ? 低拷贝蛋白质难以检测 ? 采用 放射性同位素标记 ，可大大提高蛋白质的检测 限，但后续的质谱分析的灵敏度难以满足要求 ? 加大蛋白质的上样量，可达到质谱分析的要求，但 上样量过大，容易超出电泳胶的负载量，从而降低 电泳的分辨率 （ 4 ）蛋白质的丢失 ? 疏水性蛋白质 ? 分子量大于 100kDa 蛋白质 （ 5 ）通量和自动化 ? 分离后的图像分析仍然是整个过程中较费时的步骤， 成为整个体系高通量、自动化的瓶颈 二、色谱－质谱技术 ? 色谱法原理 ? 利用样品混合物中各组分理、化性质的差异，各 组分程度不同的分配到互不相溶的两相中；当两 相相对运动时，各组分在两相中反复多次重新分 配，结果使混合物得到分离 ? 两相中，固定不动的一相称固定相，移动的一相 称流动相 ? 利用色谱分离蛋白质或者多肽的基本原理 ? 分子的混合物溶解在一种溶剂中并进行色谱分离，当 流动相流经固定相时，混合物的组分可以与溶剂以及 固定相基质分子间发生作用 ? 由于与每一相的 亲和力不同 ，所以混合物中不同组分 的移动速率会不一样 ? 与固定相亲和力低的分子会移动得很快，它们更倾向 于保留在溶剂中，而与固定相亲和力高的分子会倾向 与固定相结合而移动缓慢，从而出现滞后 ? 混合物被分离成一系列的组分，可以被洗脱并分部收 集 亲和色谱 (afffinity chromatography ， AC) ? 根据蛋白质或多肽与它们专一性 配基的亲和力 来进 行分配 ? 亲和柱上的介质含有与某些或某一类特定蛋白质具 有高亲和力配基 ? 两步洗脱 ? 首先洗脱下来的是那些无法与亲和色谱配基结合 的蛋白质或多肽 亲和去除 ? 其次洗脱下来的是挂在柱上的蛋白质或多肽 亲和纯化 离子交换色谱 ? Ion exchang chromatography ， IEX ? 基于蛋白质或多肽 所带电荷 来进行分离的，依靠移 动相中可溶性分子与含有 带电基团的固定相 之间发 生可逆性吸附达到分离目的 ? 亲和色谱中使用的两步洗脱法被使用离子强度或 pH 值逐渐增强的缓冲液的梯度洗脱所替代 反相色谱 ? Reversed-phase chromatography ? 利用蛋白质或多肽与固定相的可逆结合，然后梯度 洗脱多个组分来达到分离的 ? 蛋白质或多肽是基于其疏水性而达到分离 ? 反相树脂含有疏水性配基，如从 C4 到 C18 的烷基链 ? 在柱上的滞留能力是随着分子质量的增加而增加的 ? 首先破坏弱的疏水相互作用，然后通过逐步增加洗 脱缓冲液中的有机溶剂来形成梯度洗脱 尺寸排阻色谱 ? Size exclusion chromatography ? 凝胶过滤色谱 ? 基于蛋白质大小分离的一种技术 ? 柱子填装的是一些多孔的惰性微珠，如琼脂糖 ? 基于 分子筛 的分离过程中并不需要流动相与固定相 之间发生任何化学反应 液相色谱与 2DGE 的比较 ? HPLC 柱可以承载大体积的样品，便于更容易地富 集并分离低丰度蛋白 ? 许多在 2DGE 上难以分离的蛋白质（如膜蛋白、极 碱性蛋白等）可以选用适当的树脂轻易地分开 ? 分离出的蛋白质存在于液相而不需要进行染色 ? LC 方法可以将蛋白质和多肽同样地分离，并且可以 直接同质谱仪相连接，从而能够实现从样品制备到 质谱鉴定的全部自动化 液相色谱与 2DGE 的比较 ? LC 的不足在于不像 2DGE 那样直观 地看到蛋 白质点，并且根据蛋白质在凝胶上的位置来 推算其等电点和分子质量 分类 ? 根据流动相分 ? 以气