LORF5基因缺失鸭瘟病毒致病性评估.pdfVIP

中文摘要 鸭瘟（Duck plague, DP）是严重危害养鸭业的传染病之一，其病原为疱疹病毒科α-疱疹病 毒亚科的鸭瘟病毒（Duck plague virus, DPV ）。LORF5 基因为禽疱疹病毒特有基因之一，在DPV 中该基因功能还未见报道。本论文构建了DPV LORF5 基因缺失病毒，并对LORF5 基因缺失病 毒的增殖特性和致病性进行测定。主要研究内容和结果如下： 1. LORF5 基因缺失病毒的构建及其体外增殖特性 在 DPV CHv 感染性克隆（DPV CHv-BAC-G）基础上，利用Red 同源重组构建DPV CHv-BAC-ΔLORF5 感染性克隆，拯救该感染性克隆获得含 BAC 元件的 DPV CHv-BAC-ΔLORF5 病毒；在DPV CHv-BAC-ΔLORF5 感染性克隆上回复UL23 基因（BAC 元 件插入位点），拯救后挑斑纯化获得去BAC 元件的DPV CHv-ΔLORF5 病毒。 将 MOI=0.01 的 DPV CHv 、DPV CHv-ΔLORF5 、DPV CHv-BAC-G 和 DPV CHv-BAC-ΔLORF5 病毒分别接种鸭胚成纤维细胞（Duck embryo fibroblast, DEF），并对感染后 24 h、48 h、72 h 和96 h 病毒基因组拷贝数进行测定。结果显示：LORF5 基因缺失病毒与亲本 病毒呈现相似的增殖规律，感染后病毒量逐渐累积并均在 72 h 达到峰值。与亲本病毒相比， LORF5 基因缺失病毒增殖速度轻微下降，但各时间点病毒含量与亲本病毒含量差异不显著，表 明LORF5 基因缺失不会显著影响DPV 在DEF 细胞上增殖。 2. DPV CHv- ΔLORF5 的致病性评价及其在肝脏中的增殖规律 3 4 5 6 7 分别按10 、10 、10 、10 、10 个TCID50/只剂量将DPV CHv-ΔLORF5 病毒和亲本病毒 5 DPV CHv 接种14 日龄雏鸭，同时设立空白对照组，持续观测一周。结果显示：DPV CHv 10 、 6 7 10 和 10 个TCID50 攻毒组鸭出现高热和死亡，感染鸭观察到肝脏出血和淤血、肠道出血、胸 腺萎缩和严重出血、法氏囊萎缩出血等鸭瘟的特征性病变；而DPV CHv-ΔLORF5 各攻毒组均 6 7 未出现高热和死亡，除在高剂量攻毒组（10 和10 个TCID50 ）观察到鸭胸腺出血外，其余器官 7 未见明显眼观病变。肝脏组织学检查发现：DPV CHv 10 个TCID50 攻毒组鸭肝脏可见严重脂肪 变性、坏死和出血，而DPV CHv-ΔLORF5 同剂量攻毒组鸭肝组织仅见轻微脂肪变性和出血。 表明LORF5 缺失会降低DPV 病毒对雏鸭的致病性。 7 按10 TCID50/只的剂量分别给14 日龄雏鸭注射DPV CHv 和DPV CHv-ΔLORF5，并对感 染后1 d、2 d、3 d、5 d 和7 d 鸭肝脏中病毒进行定量。结果显示：在攻毒后5 d 内，DPV CHv-ΔLORF5 和DPV CHv 病毒在感染鸭肝脏内呈现相似的增殖趋势，均保持一定的病毒滴度 且各时间点两种病毒含量无显著性差异；5 d 后亲本病毒的滴度持续上升，而LORF5 缺失病毒 的滴度下降，显著低于亲本病毒滴度。表明LORF5 缺失不会显著影响病毒感染5 d 内在鸭肝脏 内的增殖, 但会影响病毒在鸭肝脏内的持续性增殖。 综上：LORF5 基因为DPV 复制非必需基因，该基因缺失可降低病毒对雏鸭的致病性，但 不会显著影响病毒在DEF 及感染后5 d 内鸭肝脏内的增殖。 I 关键词：鸭瘟病毒；LORF5 基因；病毒复制；病毒增殖；病毒致病性