miR-9-5p靶向leptin促进家兔前体脂肪细胞分化.pdfVIP

摘要 microRNA 是一种内源性短链非编码小 RNA ，其长度一般在22-24 nt 。研究 表明 microRNA 在脂肪细胞分化和脂肪代谢中发挥着重要作用。miR-9-5p 调控了 多种癌细胞、肝细胞和纤维细胞的分化与增殖过程，但 miR-9-5p 对脂肪细胞分 化的调控仍未见相关报道。LEPTIN 通过介导 AMPK 和 JAK/STAT 信号通路调控 脂类代谢，且LEPTIN 是 miR-9-5p 的一个潜在的靶基因，故推测miR-9-5p 对前 体脂肪细胞的分化有影响。本实验以刚出生新西兰白兔的脂肪组织为材料分离培 养前体脂肪细胞，通过人工合成 miR-9-5P 类似物转染前体脂肪细胞后诱导分化， 然后检测相关基因 mRNA 的水平。随后试验构建了 pis -CHECH-LEPTIN-3 UTR 和pis -CHECH-Mut-LEPTIN-3 UTR 重组质粒，检测荧光素酶活性。为了进一步探 索 LEPTIN 基因与家兔前体脂肪细胞分化的关系，通过 siRNA 转染细胞，然后 检测相关基因 mRNA 的水平。最后利用Western-blotting 检测过表达和抑制表达 后 PPARγ 的蛋白水平。主要结果如下： （1）miR-9-5P 的表达量在前体脂肪细胞诱导分化的过程中持续上调且在 0 d 时表达量极显著低于 9 d 时 （P0.01 ）； （2 ）leptin 基因在 1-3 月龄家兔肾周脂肪组织中的表达量持续上调，3 月龄 的表达量显著高于 1 月龄的 （P0.01 ）； （3 ）转染 miR-9-5p 模拟物 mimic 后，细胞内 miR-9-5p 的表达显著上调 （P0.01 ）。诱导前体脂肪细胞分化，结果显示mimic 可以促进前体脂肪细胞分 化，脂肪细胞分化标志基因 PPARγ 、C/EBPα 和 FABP4 基因的 mRNA 水平均显 著上升（P0.0 1 ），脂肪酸和甘油三酯的含量极显著增加（P0.01 ）。转染miR-9-5p 抑制剂，细胞内 miR-9-5p 的表达显著下调（P0.0 1 ）。诱导前体脂肪细胞分化， 结果显示 inhibitor 可以抑制前体脂肪细胞分化，标志基因 PPARγ 、C/EBPα 和 FABP4 基因的 mRNA 水平均显著降低（P0.0 1 ），脂肪酸和甘油三酯的含量极 显著降低（P0.0 1 ）；过表达 miR-9-5p 后，可以上调 PPARγ 基因 mRNA 和蛋白 质的表达水平 （P0.01 ）。抑制表达miR-9-5p 后，下调了PPARγ 基因 mRNA 和 蛋白质的表达水平 （P0.0 1 ）。 （4 ）通过双荧光素酶系统检测发现，leptin 是 miR-9-5p 的一个靶基因。 （5 ）通过干扰细胞内源性 leptin 基因的表达后发现，leptin 的表达量明显下 I 降，分化相关基因 C/EBPα、PPARγ 和 FABP4 基因的 mRNA 水平均显著上升 （P0.0 1 ）,与过表达 miR-9-5p 实验结果一致。 综上所述，miR-9-5p 通过作用 leptin 基因促进家兔前体脂肪细胞分化。 关键词：miR-9-5p ；leptin ；前体脂肪细胞；脂肪细胞分化；家兔 II Abstract MicroRNAs are endogenous short-chain (22-24 nt) non-coding small RNAs. Studies have shown that microRNA plays an important role in adipocyte differentiation and adipose metabolism. miR-9-5p regulates the differentiation and proliferation of vari