冻干管开启作业规程.docVIP

冻干管开启及制作规程 一、培养基配制要求： 1. 根据菌种库对应要求配置培养基，6支液体试管（5ml/支），三角瓶4个（30-50ml/瓶），斜面5支。 2. 全部培养基配制完成后，放置于对应培养温度和37℃无菌检验48h。 注意： 有很多无机盐培养基要将能够产生沉淀盐分开溶解（各自用10ml去离子水溶解后，再加入到主培养基中） 二、超净工作台准备 1. 将新洁尔灭原液稀释50倍，喷到台面上，或纱布浸湿后擦拭台面，或用75%乙醇擦拭或喷洒（注意不要开火）。 2. 开紫外灯照射20-30min。 3. 关闭紫外灯，开启风机，10分钟以上。 4. 在开始接种前，用75%酒精棉擦拭台面，手、枪。 5. 能够在台面上铺一块灭菌纱布。 三、冻干管开启 1. 冻干管开启：通常有滴水法和砂轮打磨法。从DSMZ买来双层菌种管需要用滴水方法，从中国有些库购置，或NRRL得到菌种管很细，滴水法极难打开，所以，需要用砂轮打磨。 滴水法：用酒精棉擦拭菌种管，尖头稍倾斜向下（以防菌种滚落到前面烫区域致死，关键！），用酒精灯外焰烧烤菌种管前端，约1min后，用无菌水快速滴加到菌种管上，此时，管上会有裂缝，继续靠火操作，用无菌镊子轻敲破碎处，将菌种管打开。 砂轮打磨法：用玻璃砂轮在菌种管一侧反复打磨，出现痕迹。接着，将该处于火上灼烧灭菌。将一张无菌牛皮纸包在菌种管上，反方向用力掰断。 2. 菌种复水：将液体培养基吸收0.5-1ml左右（视菌体量多少而定，厌氧菌加0.5ml），充足水化后，吸收100ul左右到第一支试管中（第二支和第三只分别稀释100倍和1000倍），100ul到斜面上，晃动使其均匀分布，也能够用无菌接种针涂布均匀。如有多出冻干液，则接200ul左右至摇瓶中。有些菌要求初始菌液浓度比较大，所以需将冻干液全部接种到液体试管中。剩下冻干液用EP管装好，放置于4℃冰箱中，以备不测。 开启冻干管需要准备器材：无菌水、培养基、黄蓝枪头、纱布、EP管 四、传代培养 从菌种库接出来通常称为第一代，第一代其生长可能同正常菌不一样，会出现延滞期延长等现象，所以假如一个菌出现长时间不长现象，能够延长等候时间，直至过了其2-3个生长久后仍不长，可判定菌种死亡。所以全部保种菌必需用第二代或第三代来保种。 第一代菌体进行染色、涂片，对图片资料进行保留。 五、冻干管制作 保护剂——脱脂牛奶制作：大多数菌种全部能够用脱脂牛奶作为保护剂，但DSM1616等属 微生物需要用蔗糖和明胶作为保护剂。初始菌种假如展现米色块状，通常是用牛奶做保护剂，假如展现透明状，则可能是使用明胶蔗糖或DMSO做保护剂。 a、用蓝盖瓶装20-30ml水，121℃，30min灭菌。 b、在无菌室取2-3g脱脂奶粉（BD），（10%浓度），在无菌室中加入到蓝盖瓶中，溶解完全，盖好盖子，115℃15min灭菌。将灭菌好牛奶涂布在肉汤培养基平板上，37℃检验48h，验证无菌后待用。牛奶放4℃冰箱中。 1. 冻干管通常见斜面，假如斜面生长不理想，或厌氧菌，则能够用菌液离心后沉淀来保种。 2. 正常传代，菌种长至对数生长久。将待保种菌体涂片检验，图片资料进行保留。 3. 斜面：取出新鲜斜面两支，假如菌苔较厚，则吸收1ml牛奶到EP管中，用接种环刮取菌苔，到牛奶中，混合均匀，盖好盖子，用振荡器混匀。 假如菌苔较薄，无法刮取，则吸收牛奶液到斜面中，用接种环将菌体刮到牛奶中，再用长针头吸出。 菌液：将新鲜菌液吸收无菌离心管中，离心沉淀，加入牛奶，长针头吸出。 牛奶菌悬液浓度通常在1亿个/ml。 4. 将混合好菌液用长针头吸出到冻干管中，冻干管事先用纸塞子塞好。全部做好后，用八层纱布扎好，每5-6只扎一起。 5. 菌体预冻：将制作好冻干管先放在4℃，2h后转入-20℃，2h后转入-80℃。多数细菌能够直接冻到-80℃，两小时或过夜以后，上冻干机。 制作冻干管需要准备器材：菌种、冻干管、长针头、大小纱布、牛奶、肉汤培养基（能够用LB培养基替换）、接种针、枪头、EP管 六、 冻干机使用： a、将真空泵和冻干机之间接头打至垂直，将真空泵预热。 b、将冻干机冷冻腔开关打开，待降至-52℃时，将样品放置在冷冻腔中，接头打至平行。 c、抽干8h以上，可过夜。 d、接头打至垂直，放气，待真空度显示正常，取出有机玻璃罩，取出样品，再把玻璃罩放上，抽真空。 e、待真空度达成0.1Mpa时，先把白色旋钮垂直向上，上冻干管，待冻干管全部插满后，将白色旋钮垂直向下，开始抽真空，约10min后，开始热熔封。 f、将全部管子热熔封后，将真空泵和冻干机之间接头打至垂直，关闭真空泵，将白色旋钮打至倾斜，开始往冷冻腔中缓慢进气，真空度慢慢解除。关闭冻干机。 g、将冻干机前面黑色旋钮打开，放冷凝水。 h、关闭煤气开关