2020第三节免疫检测技术的基本原理.ppt

IFA —— 双抗体夹心法测抗原 A B IFA —— 结果判断 InstantChek ? HIV 1+2 的结果判断 ( 图 像 ) 阳性 阴性 测定无效 二、免疫层析测定（ ICA ） 层析法 ? 将金标的一株单抗吸附于下端的玻璃纤维 纸上，浸入尿液，此金标单抗即被溶解， 并随尿液上行，若尿中有相应抗原，既形 成 Ag-Ab- 金复合物，当上行至中段醋酸纤 维薄膜，即与下端的另一株单抗结合并被 固定下来，显示阳性结果。其上方还有一 条抗鼠二抗，待红色金标单抗上行此处即 被固定下来，作为金标单抗质控的提示。 此种方法称金标一步法。 斑点金免疫层析试验（一） 兔抗鼠 IgG 手持端 鼠抗 HCG 单抗 金标鼠抗 HCG 单抗 尿液浸湿标志线 斑点金免疫层析试验（二） 质控线 测试线 尿样 阳性 弱阳性 阴性 无效 ICA —— 双抗体夹心法测抗原 ICA--- 竞争法测抗原 免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图 戊二醛交联法 ( 一步法） 抗体 -NH 2 + COH- （ CH 2 ） 3 -COH + NH 2 - 酶 抗体 -NH 2 =CH- （ CH 2 ） 3 -CH = NH 2 - 酶 抗体 -NH 2 =CH- （ CH 2 ） 3 -CH = NH 2 - 抗体 酶 -NH 2 =CH- （ CH 2 ） 3 -CH = NH 2 - 酶 戊二醛交联法（二步法） COH- （ CH 2 ） 3 -COH + NH 2 - 酶 抗体 -NH 2 + CHO- （ CH 2 ） 3 -CH = NH 2 - 酶 抗体 -NH 2 =CH- （ CH 2 ） 3 -CH = NH 2 - 酶 过碘酸盐氧化法 NaIO O 4 O 酶 - 五炭糖环 O NaBH 4 H O O 2 O O OH N O N 抗体 抗体 Schiff 碱 O O O O + NH 2 抗体 O O N OH OH 抗 体 标记免疫物的分离与鉴定 1 、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析 2 、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度 ELISA 的种类和变化 （一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测 IgM 抗体 （六）应用亲和素和生物素的 ELISA （一）双抗体夹心法 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原 获得待分析物的未标定抗体 将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体 加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点 洗涤除去未结合的 抗体及杂质 洗涤并除去未结合的封闭蛋白 加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物 加酶标抗体生成 抗体 — 待测抗原 — 酶标记抗体 洗涤除去其他 的复合物 未结合的物质 彻底洗涤 未结合的 加底物进行 根据颜色反应的 酶标抗体 酶催化反应 程度进行该抗原 的定性或定量测定 （二）间接法 间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检 抗体 ，故称 为间接法。 酶联免疫吸附试验 (ELISA- 间接法 ) 包被固相载体 : 用已知抗原包被 固相载体 加待检标本 : 使相应抗体与固相抗原结合 洗涤，除去无关的物质 加底物 显色 加酶标抗抗体 : 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体 根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定 （三）竞争法 此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。 用已知特异性 抗体包被 固相载体 测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与 固相抗体竞争结合 对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合 加底物显色 分别洗涤 除去未结合 的成分 分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量 对照管由于只加酶标抗原，与固 相抗体充分结合，故分解底物显色深； 测定管的显色程度则