弓形虫蛋白磷酸酶PPM2A和PPM2B的功能研究.pdfVIP

弓形虫蛋白磷酸酶PPM2A 与PPM2B 的功能研究 目录 摘要i Abstract iv 缩略词表vii 1 文献综述 1 1.1 弓形虫综述 1 1.1.1 弓形虫与弓形虫病 1 1.1.2 弓形虫生活史 1 1.2 蛋白磷酸酶综述3 1.2.1 蛋白磷酸酶分类3 1.2.2 弓形虫中蛋白磷酸酶PPM 家族的研究进展8 2 研究的目的与意义9 3 材料与方法 10 3.1 实验材料 10 3.1.1 实验动物 10 3.1.2 实验菌株、虫株与细胞 10 3.1.3 载体与质粒 10 3.1.4 引物 11 3.2 主要仪器和试剂 12 3.2.1 主要仪器 12 3.2.2 主要试剂盒 12 3.2.3 主要试剂 13 3.2.4 主要的溶液配制 13 3.3 实验方法 15 3.3.1 弓形虫的体外培养 15 3.3.2 弓形虫基因组 DNA 的提取 16 3.3.3 基因敲除相关质粒的构建 16 3.3.4 PPM2A/PPM2B 敲除株的构建及鉴定20 3.3.5 间接荧光免疫(IFA)21 3.3.6 复制试验21 3.3.7 毒力试验22 3.3.8 空斑试验23 3.3.9 重组蛋白的原核表达23 3.3.10 蛋白纯化24 3.3.11 蛋白透析25 3.3.12 磷酸酶活性检测26 3.3.13 酵母双杂交27 4 结果29 4.1 PPM2A/PPM2B 在弓形虫中的定位29 4.1.1 PPM2A 定位31 4.1.2 PPM2B 定位33 I 华中农业大学2020 届硕士毕业论文 4.2 PPM2A 和PPM2B 单/双敲除虫株的构建34 4.2.1 pUC19-DHFR 质粒的构建35 4.2.2 PPM2A/PPM2B 基因敲除虫株的构建37 4.3 PPM2A 和PPM2B 双敲除虫株的构建39 4.4 各敲除虫株的表型结果40 4.4.1 复制实验40 4.4.2 空斑实验41 4.4.3 毒力实验42 4.5 PPM2A 蛋白的磷酸酶活性检测43 4.5.1 pE-SUMO-PPM2A 质粒的构建43 4.6 PPM2A 与CaM 酵母双杂交实验46 4.6.1 pGBKT7-PPM2A 与pGADT7-CaM 质粒的构建46 4.6.2 PPM2A 与CaM 酵母双杂交试验47 4.6.3 诱饵质粒自激活检测48 4.6.4 质粒毒性检测49 5 讨论50 5.1 蛋白磷酸酶PPM 在弓形虫体内的定位50 5.2 PPM2A 和PPM2B 对弓形虫生长发育过程中的影响50 5.3 蛋白磷酸酶PPM2A 的磷酸酶活性52 5.4 PPM2A 与CaM 酵母双杂交52 6 结论54 参考文献55 致谢61 附录A 63 附录B 65 II 弓形虫蛋白磷酸酶PPM2A 和PPM2B 的功能研究 摘要 弓形虫 （Toxoplasma gondii ）是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫，能 够感染所有有核细胞，可造成怀孕母畜或者孕妇流产、产畸形胎。其生活史复杂， 具有多种感染方式，感染宿主广泛，感染阳性率高，对畜牧业发展可造成较为严 重的损伤，同时也给人类健康带来了困扰，然而，目前仍没有研制出预防弓形虫 感染的有效疫苗。参与蛋白质修饰和解除蛋白质修饰的分子一直是药物研制的重 要靶标，作为具有解除蛋白磷酸化修饰功能的金属依赖性蛋白磷酸酶 （PPMs ） 蛋白在动植物抗逆境胁迫过程中发挥着重要作用，弓形虫从速殖子转化为缓殖子 的过程是弓形虫致病的生物学基础，也是弓形虫