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GC376 抑制α属动物冠状病毒复制的分子机制研究 目录 摘要i Abstract iii 缩略语表(Abbreviation)vi 1 文献综述 1 1.1 冠状病毒3CLpro 1 1.1.1 冠状病毒概述 1 1.1.2 冠状病毒基因组学及复制过程 2 1.1.3 冠状病毒3CLpro 相关进展 4 pro 1.1.4 3CL 抑制剂研究进展 5 1.2 猪流行性腹泻研究进展 6 1.2.1 猪流行性腹泻概述 6 1.2.2 猪流行性腹泻病毒3CLpro 研究进展 7 1.2.3 猪流行性腹泻的防治措施 7 1.3 猫传染性腹膜炎研究进展 9 1.3.1 猫传染性腹膜炎概述 9 1.3.2 猫传染性腹膜炎的治疗 10 2 目的与意义 12 3 材料与方法 13 3.1 实验材料 13 3.1.1 毒株、菌株、细胞与载体 13 3.1.2 主要试剂与药品 13 3.1.3 主要仪器与设备 13 3.1.4 主要试剂的配制 14 3.1.5 生物学软件及数据库 16 3.1.6 实验所用引物 17 3.1.7 实验所用荧光多肽底物 18 3.2 实验方法 19 3.2.1 细胞传代培养 19 3.2.2 病毒毒价的测定（TCID50 ） 20 3.2.3 PEDV 病毒的扩增 20 3.2.4 抑制剂GC376 对病毒抑制效果评定 20 3.2.5 PEDV 3CLpro 的表达与纯化 23 3.2.6 FRET 测定不同荧光底物的特异性 29 3.2.7 分子对接模拟PEDV 3CLpro 与GC376 的结合 29 3.2.8 FIPV 耐药毒株的蚀斑纯化 30 3.2.9 RNA 的提取与逆转录反应 31 3.2.10 FIPV 耐药毒株全基因组PCR 扩增与突变位点分析 32 4 结果分析 33 4.1 PEDV 3CLpro 的表达与纯化 33 4.1.1 质粒构建 33 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位（毕业）论文 4.1.2 3CLpro 的大量表达纯化34 4.2 抑制剂GC376 对PEDV 的抑制效果35 4.2.1 抑制剂GC376 对PEDV 3CLpro 的IC50 35 4.2.2 抑制剂GC376 在细胞培养中PEDV 流行毒株的抑制效果36 4.2.3 Western blot 检测 GC376 对PEDV 的抑制效果37 4.2.4 IFA 法检测 GC376 对PEDV 的抑制效果37 4.3 模拟PEDV 3CLpro 与抑制剂GC376 的结合模式38 4.4 PEDV 3CLpro 的底物特异性39 4.5 抑制剂GC376 的优化40 4.6 确定FIPV 药物压力下的传代方法41 4.7 50 代FIPV 的毒价与耐药性变化42 4.8 通过蚀斑纯化法获得耐药性毒株46 4.9 抑制剂GC376 对野生型FIPV 与耐药毒株的抑制效果47 4.9.1 抑制剂GC376 细胞培养中对野生型FIPV 与耐药毒株的抑制效果47 4.9.2 IFA 法检测GC376 对野生型FIPV 与耐药毒株的抑制效果48 4.9.3 Western Blot 检测GC376 对野生型FIPV 与耐药毒株的抑制效果49 4.10 耐药性毒株突变位点的分析50 5 讨论 52 5.1 抑制剂GC376 对PEDV 的有效抑制作用52 5.2 抑制剂GC376 对其他冠状病毒的抑制效果52 5.3 关于抑制剂GC376 的优化方向53 5.4 冠状病毒对抑制剂GC376 产生耐药性的分子机制53 5.5 抑制剂GC376 作为新型冠状病毒候选药物的潜力54 5.6 后续可开展的研究工作55 6 结论 56 参考文献 57 致谢 62 II