2.4.2 cDNA文库的构建大学生物学.pdf

cDNA文库的构建 LOGO cDNA文库 某种生物基因组转录的部分或全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克 隆载体重组 ，贮存在一种受体菌群体中 ，这样的群体称为cDNA文库。如果此群体 中只贮存该基因组的部分cDNA ，则称为部分cDNA基因文库。 cDNA文库的构建过程 Oligo dT或随机引物 RNA提取 分离mRNA 合成cDNA第一链 连接载体 连接接头 补平cDNA链末端 合成cDNA第二链 噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化 参数测定 分装、保存 AAAAAAA TTTTTTTT 分离纯化mRNA 通过真核生物mRNA分子的3端的polyA尾与oligo （dT ）发生碱基配对的方法 分离纯化 胞质中RNA混合物 在杂交条 件下混合 洗掉rRNA和tRNA 低盐缓冲液中的洗脱过柱 纯化的mRNA 检测mRNA的完整性 1、利用麦芽提取物或兔网状红细胞裂解物的无细胞翻译系统来检测mRNA是否 能被翻译 2、用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 mRNA 5’ AAAAA-3’ HO-TTTTT -5’ 逆转录酶 P 四种 dNTPs mRNA 5’ AAAAA-3’ 3’ TTTTT -5’ cDNA P 末端转移酶 dCTP mRNA 5’ AAAAA-3’ 3’-CCCCCCC TTTTT -5’ cDNA P 碱 (水解 RNA