【国自然】非整合人诱导性多能干细胞（iPS）及相关技术用于β地中海贫血治疗的研究.docxVIP

项目名称： 非整合人诱导性多能干细胞（iPS）及相关技能用于β地中海贫血医治的研讨 首席科学家： 潘光锦 中国科学院广州生物医药与健康研讨院 起止年限： 2012.1至2016.8 依托部分： 中国科学院 一、要害科学问题及研讨内容 1、安全高效，具有临床有用性的非整合iPS新技能的优化及树立。 安全高效取得非病毒非整合iPSC的新技能 树立归纳的诱导系统取得非病毒非整合的iPSC：运用mRNA及microRNA诱导体细胞取得iPSC，挑选能够加快iPSC重编程的小分子化合物及蛋白；挑选高效的iPSC诱导培育液。在此根底上，树立归纳的诱导系统取得非病毒非整合的iPSC。 iPSC的判定：核型、基因表达、体外分解才能、体内多能性检测等多方面检测iPSC是否契合干细胞的规范；分子水平检测外源基因的刺进；测序剖析iPSC的基因组安稳性。 树立非病毒非整合小鼠ESC样的人类iPSC（ESC-like-iPSC） 挑选能够安稳培育 ESC-like-iPSC的培育环境：经过传统的病毒诱导取得小鼠ESC样的人类iPSC（ESC-like-iPSC）；挑选小分子化合物安稳培育ESC-like-iPSC；挑选mRNA及microRNA支撑ESC-like-iPSC的自我更新； 树立非病毒非整合ESC-like-iPSC：开发诱导取得ESC-like-iPSC的诱导系统；在全基因组表达、小RNA表达等方面比较两种不同的iPSC的差异。 2、运用体外受精胚胎树立多株正常人及地贫患者的ES细胞系。比照地贫iPS及ES，点评iPS多能性，安全性等运用方针。 树立非整合β地中海贫血患者iPS细胞库，约含各骤变类型β地中海贫血iPS细胞株50～100株。 优化和完善树立人胚胎干细胞的技能系统，并在此根底上树立地贫胚胎干细胞库。本研讨拟对现有的胚胎干细胞培育技能进行改善：运用不同发育阶段的IVF抛弃的胚胎（从桑椹胚到孵出的晚期囊胚）别离的人ESC细胞进行均一性研讨，寻觅最优化的细胞别离时刻；经过对人源性的养殖层细胞及无养殖层培育系统进行优化，树立安全、安稳的人胚胎干细胞系技能渠道。并在此根底上，树立不同骤变类型β地中海贫血人胚胎干细胞株10株以上。 非整合β地中海贫血患者iPS细胞与地贫胚胎干细胞比较性研讨。比照研讨地贫ES及iPS，树立其表观遗传和基因表达的数据库。运用基因芯片及高通量DNA测序技能，比照检测地贫iPS与ES在SNP，DNA 甲基化(DNA methylation)，组蛋白润饰(Histone Modification)，外显子序列(Exon Sequencing)等方面的差异。全面点评iPS在全能性，表观遗传学，基因组完好性，相关功用性细胞分解的才能等，清晰造血分解用iPS的全能性，安全性等运用规范。 3、研讨修正地贫iPS的骤变基因。讨论和点评经基因修正等操作后iPS的基因组及表观遗传的安稳性，多能性及安全性等方针。树立多样性的非整合地贫iPS细胞库。 运用基因重组技能修正骤变基因。基因修正后iPS基因组及表观遗传学安稳性的研讨。经过基因芯片的技能手法检测基因修正后iPS的SNP，CNV等代表基因组安稳性的方针。并进行外显子测序(Exon Sequencing)来确认有无重要基因产生骤变等。运用CHIP结合高通量测序技能确认经体外基因修正后的iPS在组蛋白润饰，DNA甲基化等表观遗传方面的安稳性。 基因修正后iPS多能性的坚持。研讨经体外基因操作后，iPS坚持其多向分解潜能的才能。经过非定向的分解手法如裸鼠体内畸胎瘤的构成，体外类胚胎（EB）的构成等手法比照基因修正前后地贫iPS的分解潜能。并经过定向分解的办法如，神经分解，血液分解等比照讨论iPS在基因修正进程中的多能性坚持。 4、iPS功用性血液分解的研讨及依据动物模型的功用点评。 运用与不同人造血安排来历的的基质细胞，包含间充质干细胞共培育系统，优化树立iPS的功用性血液分解及造血干、祖细胞体外扩增有用性技能。树立依据动物模型的造血干细胞分解，移植及安全性多功用的点评技能和方针。 选用不同造血安排来历人世充质细胞与人胚胎干细胞及iPS细胞共培育诱导造血分解，与现在较常用的EB构成及小鼠或其它安排来历的基质细胞共培育系统进行诱导功率的比较，挑选有用进步造血干细胞诱导功率的iPS细胞分解培育条件。 运用体外细胞长周期培育、单细胞培育分解试验以及体内NOD/SCID鼠造血重建试验、骨髓竞赛移植试验等， 与脐带血HSC细胞比较，点评多种来历的iPS分解来历的HSC/HPC体内定向归巢、造血重建等生物学功用。比较iPS细胞来历的造血干细胞与脐血造血干祖细胞向造血各系细胞分解，尤其是红系分解才能，并对相应的调控机制进行讨论，偏重研讨Wnt3a、PGE2等分子