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第三篇 细胞工程的应用技术 第23章细胞的大量培养 近年来细胞工程的相关技术发展十分迅速，尤其是在实际应用和生产工艺上获得 了可观的成就，当前人们己经能够通过大量细胞培养的细胞工程,生产多种单克 隆抗体，激索，细胞因子，病毒疫苗和具有特殊功能的效应细胞等?因实验室采用 的细胞培养技术获得的细胞量有限，不能满足生产的需求,必须改用超产培养技 术方可获得大量细胞，FI前这种技术利啖繁多，归纳起來有三大类：⑴单层静置 贴壁培养法；（2）悬浮培养法；（3）固定化培养法?这些超产培养技术通常是研究开 发机构及生产性企业常采取的方法，在我国己开始进入研究和试生产阶段，各大 生物制品研究所及生化制药和生物工程公司的制药企业，根据生产需要而采用了 切实可行的不同方法和技术设备?下面介绍一些有关细胞大量培养的方法（如图 23-1）,在实际应用和生产实践屮可根据需要來选择下列细胞大量培养的方法. 转管及转瓶培养 单层静置贴壁培养 旋转园柱管培养 多层繁殖器 细2.多层托盘式装置 胞多层培养3. Opticell培养系统 大4.塑料软片培养系统 量5. Heli-cel薄膜卷带式培养 培固定化培养 养微载体培养 的中空纤维灌注培养 方玻璃珠床培养 法包被细胞培养 翻滚培养 旋转培养 悬浮培养电磁搅拌培养 振荡培养 振动器培养 滋养器装置搅拌牛物反应器 发酵罐培养 气动发酵器第一节培养耍素控制及其参数的测定 一,细胞的定量测定 （-）细胞数量的测定:采用常规细胞计数法（见前第一篇第九章第四节）测定细胞 总数及活细胞数,并计算细胞存活率. （二）细胞活性的测定 直接测定:计数法屮的细胞存活率的测定虽能显示细胞的生长活力，但误差大, 故常采用MTT法或3H-TdR掺入法可准确地显示细胞的代谢状态和生长繁殖的活 力.（方法见第一篇第九章第五节） 间接测定 细胞活性间接测定法是基于测定细胞代谢活性Z上的.最为普通的参数是葡萄糖 的利用及生物氧化后的代谢产物，如乳酸或内酮酸产物等. (二)培养要孝控制 容器生长玉面的选择和处理(静置贴壁培养)- 细胞培养容器的生长表面为玻璃，不锈钢(或钛)，塑料表面?玻璃应选用明矶-硅 硼酸钠玻璃(例如Pyrex),反复使用会减少细胞的贴壁，用lmmol/L醋酸镁处理能 获恢复；塑料表面常用聚苯乙烯，此外还可用聚乙烯多聚碳酸盐,Perspex, PVC聚 四氟乙烯(Teflon)玻璃纸及醋酸纤维索等，经正确预处理后都是合适的.不锈钢 (或钛)对细胞牛长是合适的，但处理和清洗吋要用酸洗(10%硝酸,3. 5%氟氢 酸,86. 5%水)以利除去表面污物. 为了利于细胞贴壁,培养表而要求使用糖蛋白和/或二价阳离子(Ca++,Mg++)交联, 研究最多的糖蛋白为纤粘素?培养表面也可用胶原以及多聚氨基酸覆盖壁表面. 胶原可以购买(VitrogenlOO, F10w实验室)，胶原在生长表面对细胞生长有利，也 可用于覆盖微载体小珠表面(Cytodex3, Pharmawa Fine Chemicals). 悬浮培养基屮的添加剂 通常将轻甲基纤维钠(纤维素)(5?20e?p. s)加入悬浮培养基小(0. 11%浓度) 以防止搅拌,通气和灌注吋对细胞产生机械损伤(预先应做毒性预试验). 通常将 pluronic F=68 (polyglgcol) (BASF, wyandot)消泡剂加入培养液中 (0. 11%浓度)，可防止血清在搅拌通气屮产生泡沫，此物质也可阻止细胞贴壁(预 先应做毒性预试验)? 培养条件 温度 适宜温度为37°C,通常选择36°C±0. 5上下波动进行控制，培养液要事 先预温，以利细胞适应环境. pH理想的pH值为7. 2,开始培养吋pH值可略低一些，次日细胞开始快速生长 时可将pH调至7. 4已进行控制,常加入Hepes以稳定pH. 细胞生长期的选择应选择细胞对数生长期后期的细胞接种培养，以利细胞生 长繁殖. ⑷接种细胞密度细胞接种密度要根据细胞系种类的特性以及培养基而定，指导 浓度为 5X104—2X105 细胞/mL 或 5X103—2X104 细胞/mL. (5)搅拌速度不同细胞应通过实验找出合适的搅拌速度，对于悬浮细胞可用 100?500r/min,通常在200?350 r/min Z间，而微载体培养细胞通常使用20? 100 r/min范围之内. 培养基和营养物质的选择 悬浮培养常用Eagle (BME或MEM)血清成分为2?5%,但谷氨酰胺需不断补充，同时 可补充胱氨酸，精氨酸，培养2?3天后还应补加葡萄糖以利细胞稳定生长，若为 了加速生长可在培养基小加入适量生长因子,激素等，如:胰岛素(5mg/L),转铁蛋 白(5?35mg/L),胆胺(20 u mol/L)及硒(5 u g/L)等,C++, Mg++应尽量