分子克隆及细胞培养基本实验方法.docVIP

分子克隆及细胞培养基本实验方法 1 ?载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后,储存于?20°C或?70°C备用。（甘油菌中甘 油的浓度为20-30%均可） 1?2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌 种），37°C培养过夜（约16小吋）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基屮，37°C振荡过夜（约12?16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中, 37°C振荡过夜（约12?16小时）。 1?3小规模制备质粒DNA (QIA miniprep kit ) 适于从1?5ml菌液屮制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1 OOOrpm, 1分，弃上清 ⑵以250ul PI重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2,颠倒4?6次轻混，约2?3分（轻混以免剪切基因组DNA,并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3,迅速颠倒4?6次轻混;离心10分，13 OOOrpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30?60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 （7）加入0.75ml PE洗，离心30?60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入5（）ul EB,静置1分（EB37°C预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽口」能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig （ul） pAdTrack-CMV （ul） 335Total 3 35 Total : 30 ul 30ul TOC \o 1-5 \h \z dd.H2O 17 lOXNEbuff 2 3 ?10XBSA 3 ④底物DNA 5 ⑤内切酶Hindlll Xba I ⑵37°C水浴1?2小时，必要吋延长酶切吋间至12小吋 ⑶酶切2小时后，取5-10ul电泳观察酶解是否完全 ⑷65 °C灭活内切酶 (5L20C保存备用 1.5 回收目的片段(QIAquick Gel extraction Protocol) ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG (300ul QG/100mg胶)；＞2%的胶，应加大QG用量(600ul QG/100mg)； ⑶水浴50°C, lOmin,每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黃色，与buff QG和似； 当DNA片段在＜500bp或＞4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp?4kb吋，加入异戊醇并不能提高产量； 结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm, lmin；(柱容量800ul/次); ⑹ 洗：0.75ml buff PE,离心13000rpm, lmin； (DNA用于盐嫩感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min)；弃离心液，再离心13000rpm, lmin,以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30?50ul buff EB或出。(滴于 QIAquick 膜上！),静置 lmin,离心 15000rpm, lmin； (8)-20 °C保存备用。 1.6连接反应 ⑴体系构成(反应体系20ul,载体：H的片段二1： 3-5,摩尔数比) 反应组份 数量(ul) dd.H2O T4 lOXbuff 载体D N A (ul) 冃的片段(ul) 8 2 1 8 ④T4DNA连接酶 1 Total : 20 ul ⑵16°C水浴12?16小吋(过夜) ⑶直接用于转化或?20°C保存备用 1.7感受态细胞的制备 ⑴菌种10-20ul A 5ml LB液体培养基(不力口 Amp), 37°C振摇4-6 hr,至中对数 期； 菌液冰浴lOmin,分装2管，离心(4°C, 4 000-6 OOOrpm)收菌； 弃上清,将菌体悬浮于800ul O.IM CaCl2 (冰预冷)中，冰浴lOmin,离心 (4°C, 4000-6000rpm)； 再将菌体悬浮于200ul O.lMCaCh (冰预冷)中，冰浴,12-24hr可用。菌体沉 淀时，重悬操作要轻。 1.8转化 新鲜感受态细胞200ul,加入2-10ul连接产物，轻轻旋转混合，冰浴30-60min； ⑵42°C热休克90sec,勿摇动试管，再冰浴2min； ⑶加入液体LB培养基(无抗生素)800ul, 37°C温和振摇45-60min； ⑷离心 4000-6000rpm, 2min,弃去 900ul ±清; 剩余物重悬细菌，铺Amp板，平放20min