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2021/3/26 * （二）氨基酸自动分析仪 1．原理 利用氨基酸极性和分子量大小不同等性质,使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色谱柱顶端后,采用不同的pH值和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来 。洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色,从而定量各种氨基酸。 定量测定的依据是氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物,故需在另外波长处定量测定。 2.操作方法 （1）样品处理:测定样品中各种游离氨基酸含量,可以除去脂肪等杂质后,直接上柱进行分析。测定蛋白质的氨基酸组成时样品必须经酸水解,使蛋白质完全变成氨基酸后才能上柱进行分析。 2021/3/26 * 酸水解的方法:称取经干燥的蛋白质样品数mg,加入2m1 5.7mol/L盐酸,置于110?C烘箱内水解24小时,然后除去过量的盐酸,加缓冲溶液稀释到一定体积,摇匀。取一定量的水解样品上柱进行分析。 如果样品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂质,必须将样品预先除去杂质后再进行酸水解处理。去除杂质的方法如下: 去糖和淀粉:把样品用淀粉酶水解。然后用乙醇溶液洗涤,得蛋白质沉淀物。 去脂肪:先把干燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机溶剂离心或过滤抽提,得蛋白质沉淀物。 去核酸:将样品在10%氯化钠溶液中,85?C加热6小时,然后用热水洗涤,过滤后将固形物用丙酮干燥即可。 2021/3/26 * 去无机盐:样品经水解后含有大量无机盐时还必须用阳离子交换树脂进行去盐处理。 2）样品分析:经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量视所用自动分析仪的灵敏度而定。一般为每种氨基酸0.1?mol左右(水解样品干重为0.3mg左右)。 测定必须在pH5~5.5、100?C下进行反应时间为10~15分钟,生成的紫色物质在570nm波长下进行比色测定。而生成的黄色化合物在440nm波长下进行比色测定。 3．结果计算 根据峰出现的时间来确定氨基酸的种类。从峰的高度和宽度可计算氨基酸的含量。 2021/3/26 * 用阳离子交换柱分离及测定氨基酸所得图谱如图3.3。 2021/3/26 * （三）气相色谱法 原理 将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色谱分析的衍生物—三氟乙酰基二丁酯。它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐(TFAA)的酰化两个步骤。将酰化好的氨基酸衍生物进行气相色谱分析。 （四）液相色谱法 原理 蛋白质样品经酸或碱水解后再用丹磺酰氯进行衍生化作用而溶解于流动相溶液中,采用高压液相色谱仪分离并用荧光检测器进行测定,即可测定出各种氨基酸的含量。 2021/3/26 * 四、个别氨基酸的定量测定 （一）赖氨酸的测定 1．原理 三硝基苯磺酸（TNBS）能与蛋白质的氨基反应,由于蛋白质的N-末端的α-氨基和赖氨酸的ε-氨基是游离的,所以能与TNBS起反应,反应后生成的TNP-蛋白质经部分酸水解后分别产生含有α-TNP-氨基及ε-TNP-氨基的小肽碎片。在酸性溶液中前者可用有机溶剂抽取除去,而酸溶液中留下的ε-TNP-氨基含量即可在340nm处测定,此含量相当于蛋白质中的赖氨酸的含量。 2．操作（略） 3．说明 （1）对于大分子蛋白质,由于部分氨基埋于分子内部,受到构型上的阻碍与TNBS反应有可能不完全,因此应先使蛋白质变性（在碱性条件下保温数小时）,使分子内部的氨基充分 暴露后再与TNBS反应。 2021/3/26 * （2）若蛋白质N-末端也是赖氨酸,在用有机溶剂抽提时也会被除去,因而实际所测的赖氨酸含量会偏低。但由于蛋白质的分子量很大,总的ε-氨基远多于N-末端的ε-氨基,所以影响不大。 （二）色氨酸的测定 1．原理 色氨酸能与二甲氨基苯甲醛（DAB）试剂反应生成蓝色产物,其蓝色的深浅与色氨酸的量成线形关系,因此可以利用作为定量测定之用。 2021/3/26 * 第四节 脂类的测定 2021/3/26 * 一、粗脂肪的测定 1．原理 将经预处理而分散且干燥的样品用无水乙醚或石油醚等溶剂回流提取,使样品中的脂肪进入溶剂中,回收溶剂后所得到的残留物,称为脂肪 (或粗脂肪)。 一般食品用有机溶剂浸提,挥干有机溶剂后称得的重量主要是游离脂肪,此外,还含有磷脂、色素、树脂、蜡状物、挥发油、糖脂等物质,所以用索氏提取法测得的脂肪,也称粗脂肪。 2．适用范围与特点 此法适用于脂类含量较高,结合态的脂类含量较少,能烘干磨细,不易吸湿结块的样品的测定。 此法是经典方法,对大多数样品结果比较可靠,但费时间,溶剂用量大,且需专门的索氏抽提器。 3．仪器 索氏抽提器 2021/3/26 * 2021