《生物化学》第8章蛋白质的分离纯化.pptx

第 八 章 生化分离技术及应用;一. 离心机;;;;⑵ 高速冰冻离心机，0.6-2.5万;⑶ 超速冰冻离心机，2.5-8万或更高;;;;;;;;⒈ 层析法的基本原理;⑵ 按两相所处的状态分类 流动相有两种状态： *液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相 液-固层析 气-固层析 气相层析气-液层析 液相层析液-液层析;;;;;;;;;;⒋ 分配薄层层析 支持物不同，分配、离子交换、凝胶过滤等;;;;;2、影响疏水相互作用的因素;;;;;;;;;⒉ 离子交换层析步骤和发生的变化;;;;;;;;;;;;，;;;② 另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电 泳、板电泳、柱电泳。 ③ 据用途不同分为：分析电泳、制备电泳、定量、免疫电 泳。;㈡、电泳的基本原理;;;;;;;;;;双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要 技术，结合了等电聚焦和SDS电泳;;;;;;;;四、蛋白质的性质;;;??、蛋白质的沉淀 蛋白质胶体溶液稳定性是有条件的，与质点大小、 电荷和水化作用有关。 ⒈盐析法：中性盐（硫酸胺、硫酸钠和氯化钠）使 蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 ⒉有机溶剂沉淀： 甲醛、乙醇、丙酮 引起蛋白质脱去水化层，降低介电常数，增加带 电质点的相互作用引起沉淀。;;;;;⒉ 分离纯化的要求和目的 ⑴ 纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研 究蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的 蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都 要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到 一定纯度即可，不要求均一。 ⑵ 活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性 ⑶ 收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少 损失，而且提纯步骤越多，损失越大。 增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性 设法除去变性的和不要的蛋白质，目标蛋白质产量达到 最高值。;;蛋白质纯化的策略：;㈡、蛋白质混合物纯化方法;;;;;;⒋ 有机溶剂分级沉淀;⒌ 利用温度对蛋白质溶解度影响 在一定温度范围内球状蛋白质的溶解度 随温度升高而增加。 超过一定范围，大部分蛋白质变得不稳 定开始变性、凝聚而沉淀下来。 大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此 蛋白质分级操作一般在较低的的温度下进 行。;;;;;⑵ 层析性质的考查;⑶ 免疫化学法：免疫扩散、免疫电泳、双向免疫 电泳 酶标免疫分析、发光免疫分析和Western blotting ⑷ 蛋白质化学结构分析法 N-末端分析：每摩尔蛋白质应当有整数摩尔的 N-末端氨基酸 ⑸ 超速离心沉降分析 用于不适用于电泳法的分析。;;;㈤酶的分离提纯;