分子诊断学：第四节 核酸分子标志物.pptVIP

CellSearch?系统检测CTC的原理 循环肿瘤细胞自动样本处理系统采用一系列免疫磁性分离过程来分离需要的细胞，并采用荧光标记单克隆抗体对细胞进行染色。 循环肿瘤细胞结果分析系统检测循环血中的上皮来源的肿瘤细胞。 使用CellSearch循环肿瘤细胞试剂盒来对全血中源于上皮(CD45-、EpCAM+以及细胞角蛋白8、18+和/或19+)的循环肿瘤细胞(CTC)进行计数。 乳腺癌、前列腺癌大于5个CTC/7.5ml外周血，结直肠癌大于3个CTC/7.5ml外周血为阳性。 CTC检测技术的临床应用 CTC检测的局限性 在制定患者治疗方案时， CellSearch?的检测结果须结合所有获得的临床诊断信息（包括影像学、实验室检测等），以及患者体检状况而对患者的病情作出适当的判断。 CellSearch? 结果与影像学诊断不一致的情况表明患者处于病情从非进展到进展的过渡时期。 正在接受阿霉素治疗的患者，应在阿霉素注射后至少7天才能抽血做CellSearch?检测。 CellSearch?测试检测不到不表达EpCAM的CTC，也测试检测不到表达EpCAM，但不表达CK8、CK18及CK19的CTC。 （二）单细胞测序技术 单细胞测序（single cell sequencing，SNS），是利用多重置换扩增技术（multiple displacement amplification, MDA）等 ，从一个细胞的基因组中分离出DNA，准确定量一个单细胞核中基因拷贝数目。 由于癌细胞中基因组部分被删除或者扩增，引起关键基因的缺失或者表达过量，结果干扰了正常细胞生长。利用SNS技术能够发现人体单个肿瘤细胞里的基因拷贝数变异（ CNV ）。 SNS技术有利于对隐藏在人体循环系统里的CTC进行全基因组或者转录组测序 第四节 核酸分子标志物 核酸分子标志物的分类 随着分子生物技术的发展以及对基因组学、转录组学和代谢组学的研究，引入了核酸分子标志物（nucleic molecular biomarker）的概念。 某些分子标志物可反映患者基因功能、蛋白质功能及代谢功能，对疾病的早期诊断、指导临床治疗、提高疗效、减轻患者负担以及节省医疗资源，实现个体化治疗有重要意义。 根据检测的特点将核酸分子标志物分为：基因突变位点、基因多态性位点、等位基因等。 （一）基因突变 基因突变的发生与DNA的复制和损伤修复、单基因遗传病、癌变及衰老有关。基因突变位点是常用的分子标志物。 致病基因突变中，70%是点突变（49%为错义突变），23%为小片段插入/缺失，7%为大片段插入/缺失。 HBB基因突变 正常成人的血红蛋白是由两条α-肽链和两条β-肽链所构成。 镰形细胞贫血症患者的α-链完全正常，但β-链的DNA序列在起始端的第20位核苷酸发生点突变，由原來的GAG-变为-GTG-（A-T），则在翻译时，β-链近N 端的第6位氨基酸由谷氨酸-缬氨酸。 BRCA1基因突变 BRCA1基因定位于17q21，约100个kb，BRCA1编码蛋白的N末端序列含有一环状结构域，能够与BRCA1相关蛋白结合。 野生型BRCA1基因属于抑癌基因， BRCA1基因突变使其具有的抑癌功能受影响，已发现的BRCA1/2的突变有数百种之多，其中有BRCA1基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50%～85%和15%～45% 。 FⅧ基因突变 在FⅧ基因的2535位核苷酸发生了C→A碱基置换，导致826Asp(GAC)→Glu(GAA)错义突变。 A 正常对照 B 血友病A患者 （二）基因多态性位点 人类基因多态性来源于基因组中重复序列拷贝数的不同、单拷贝序列的变异以及双等位基因的转换或替换。 分为：DNA片段长度多态性（RFLP）、微卫星多态性（STR）、单核苷酸多态性（SNPs）及拷贝数多态性（CNVs）。 基因多态性位点与疾病的易感性有关。 FⅧ基因多态性位点 利用致病基因内外的RFLP作为特异分子遗传标志物，通过家系成员间的连锁分析确定血友病A基因的遗传情况。 鼻咽癌基因多态性位点 鼻咽癌是一种常见于中国南方的上皮性恶性肿瘤，常见为3号染色体结构异常。 用STR分析方法发现低分化鼻咽癌患者在染色体3p21-26区域的的等位基因杂合性丢失频率为66.7%，提示该区域内存在一个或多个与肿瘤发生密切相关的抑瘤基因。 鼻咽癌患者染色体3p21-26的16个微卫星多态性位点等位基因杂合性丢失检测结果 （三）等位基因 基因的多态性导致相关的基因座位形成多个等位基因（复等位基因），这些等位基因成为了分子标志物的一种。 等位基因的检测是针对多态位点进行。临床上常用于基因分型和肿瘤靶向药物的“靶标”检测 。 等位基因与疾病的易感