有关核酸提取与鉴定的基本实验课件.pptVIP

? ? （ 6 ） 将沉淀物（约 5m1 ）悬浮于 5 倍体积的 pH8.0 ， 0.0 15 mol/L NaCl – 0.1 mol/L EDTANa2 溶液中，搅匀， 然后边搅拌边慢慢滴加 5%SDS 溶液，直至 SDS 的最终浓 度达 1% 为止（应加多少毫升 ? ）。（此时溶液变得十分黏 稠，若不黏稠应重做。）然后，加入固体 NaCl 使最终浓度 达 1mol/L 。继续搅拌 30 ～ 45min ，以确保 NaCl 全部溶解， 此时可见溶液粘稠度下降。 （ 7 ） 将上述混合溶液倒于一个 300ml 的带塞三角瓶中， 加入等体积的氯仿– 异戊醇，振荡 10min 。室温 3 000r/ min 离心 10min （为什么可以在室温操作 ? ），此时可见离 心液分为 3 层：上层为水溶液，中层为变性蛋白块，下层为 氯仿– 异戊醇。小心吸取上层水相，记录体积，放入三角 瓶中，向水相中加入等体积氯仿– 异戊醇，振荡，离心， 如此重复抽提 2 – 3 次，除净蛋白质。 ? ? ? （ 8 ） 最后 1 次离心后，小心吸取上层溶液（不要吸取下层 氯仿），记录体积，放入干燥小烧杯中，加入 2 倍体积预冷 的 95% 乙醇。边加边用玻璃棒慢慢搅拌，随着乙醇的不断 加入可见溶液出现黏稠状物质，将黏稠丝状物尽可能多的 缠在玻璃棒上。黏稠丝状物即是 DNA 。 （ 9 ） 将所得的 DNA 从玻璃棒上取下，用 75% 乙醇洗 2 次， 置于干燥器中抽干，称取重量，计算产率。 （ 10 ） 按200μg/ml的浓度称取一定量 DNA ，溶于 0.01 mol/L NaOH 溶液或 pH8.0 TE 缓冲液中（干燥 DNA 不易 溶解，应在测定前几天预先溶解）。 有机溶剂抽提法 ? ? ? ? ? ? 1 、切取组织 5g 左右 , 剔除结缔组织 , 吸水纸吸干血液 , 剪碎放 入研钵 ( 越细越好 ) 。 2 、倒入液氮 , 磨成粉末 , 加 10ml 分离缓冲液。 3 、加 1ml 10% SDS, 混匀 , 此时样品变得很粘稠。 4 、加 50ul 或 1mg 蛋白酶 K, 37℃保温 1-2h, 直至组织完 全溶解。 5 、加 1ml 5mol/L NaCl, 混匀 ,5000rpm 离心数秒钟。 6 、取上清液于新 EP 管中，用等体积酚 : 氯仿 : 异戊醇 (25:24:1) 抽提。待分层后 ,3000rpm 离心 5 分钟。 有机溶剂抽提法 ? ? ? ? ? 7 、取上层水相至另一新 EP 管 , 加 2 倍体积乙醚抽提 ( 在通风 橱中 ) 。 8 、移去上层乙醚 , 保留下层水相。 9 、加 1/10 体积 3mol/L NaAc, 及 2 倍体积无水乙醇颠倒混合 沉淀 DNA 。室温下静置 10-20 分钟， DNA 沉淀形成白色絮状 物。 10 、用玻璃棒钩出 DNA 沉淀 ,70% 乙醇中漂洗后 , 在吸水纸上吸 干 , 溶解于 1ml TE 中 ,- 20℃保存。 11 、如果 DNA 溶液中有不溶解颗粒 , 可在 5000rpm 短暂离心 , 取 上清 ; 如要除去其中的 RNA, 可加 5μL RNaseA(10 μ g/μL), 37℃保温 30 分钟 , 用酚抽提 后 , 按步骤 9-10 重沉淀 DNA 。 SDS 法 实验原理 ： DNA 主要存在于细胞核中。通过研 磨和 SDS 作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白 质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重 复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋 白质； RNase 降解 RNA ，从而得到纯净的 DNA 分子。 ? 试剂配制 ? ? 1 、 Tris – HCL 1mol/L PH8.0 50ml 40ml ddH 2 O ， 6.057g 固体 Tris 放入烧杯中溶解，用 浓盐酸调 PH 值到 8.0 ， ddH 2 O 定容至 50ml ，高压灭 菌后，降至室温，4℃保存备用。 2 、生理盐水 : 0.85%NaCL 100ml 在 20ml ddH 2 O 中溶解 0.85g 固体 NaCL ，定容至 100ml ， 摇匀后，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保 存备用。 此 ppt 下载后可自行编辑 有关核酸提取与鉴定 的基本实验 哺乳动物细胞总 RNA 的提取与纯化 经典方法：异硫氰酸胍 - 酸酚法 实验原理：高浓度强变性剂异硫氰