产胞外多糖的苏云金芽孢杆菌的筛选及发酵工艺优化.docxVIP

产胞外多糖的苏云金芽孢杆菌的筛选及发酵工艺优化 多糖是组成细胞的重要成分之一，是除核酸、蛋白质等生物大分子以外组成生命体的主要高分子有机化合物近年来随着糖生物学的发展，微生物胞外多糖因其在产物结构，生产成本，生产周期以及独特性能等方面所体现的优势而得到广泛的研究与开发当前广泛利用液态发酵法生产微生物胞外多糖以提高胞外多糖的产量，张红艳等1材料与方法1.1 材料1.1.1 实验菌株苏云金芽孢杆菌BT-IX17（保藏于江南大学糖生物制造与生物反应器研究室）。1.1.2 实验试剂葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨、K1.1.3 培养基及测定指标固体培养基（g/L）：蛋白胨 10.0，酵母提取物 5.0，NaCl 10.0，琼脂粉20，调节pH 7.0~7.2，121 ℃ 灭菌30 min。活化培养基（g/L）：干酪素 5.0，葡萄糖 1.0，酵母提取物 1.0，K种子培养基（摇瓶）（g/L）：葡萄糖 10.0，酵母提取物 8.0，玉米浆 4.0，NaCl 3.0，调节pH 7.0~7.2，121 ℃ 灭菌30 min。基础发酵培养基（摇瓶）（g/L）：葡萄糖 15.0，黄豆饼粉8.0，酵母提取物5.0，NaCl 3.0，调节pH 7.0~7.2，121 ℃ 灭菌30 min。测定胞外多糖的方法，其中总糖含量采用苯酚-硫酸法胞外杂多糖含量（g/L）=发酵液中的总糖含量（g/L）-培养基中残糖含量（g/L）1.2 实验方法1.2.1 目的菌株筛选及确定菌株活化培养：将从纳豆中筛选而来的菌株BT-IX17在活化培养基中培养24 h，之后用接种环将菌株转接到斜面固体培养基上，于恒温细菌培养箱37 ℃倒置培养约24 h，最后置于4 ℃保存备用。接着从保存的斜面上挑取1环菌苔，转接到固体培养基上。通过形态学分析，生理生化鉴定以及16S rDNA测序确定目的菌株类型。1.2.2 发酵培养基成分的优化以基础发酵培养基的成分和浓度为初始水平，选择不同碳源（麦芽糖，蔗糖，果糖，半乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖），氮源及其复配（黄豆饼粉，玉米浆，酵母粉，大豆蛋白胨，鱼粉蛋白胨），无机盐离子(KH1.2.3 发酵培养条件的优化采用上述优化好的最佳培养基成分进行发酵培养条件的优化，测定不同接种量（2%，4%，6%，8%，10%），pH（6.5、7.0、7.5、8.0），装液量（50、80、100、120 mL）及温度（25、28、30、34、37 ℃）对菌株BT-IX17胞外多糖产量及生长的影响。1.2.4 Plackett-Burman实验设计优化胞外多糖产量依据上述1.2.3和1.2.4的单因素试验结果，利用Plackett-Burman设计（1.2.5 采用Box-Benhnken实验设计优化使用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken中心组合设计试验，采用响应面法在3因素3水平上对EPS产量进行优化，以EPS产量（g/L）为响应值，试验设计如下表。1.2.6 数据统计分析上述实验每组重复3次，以“平均值±标准差”形式表示结果。在单因素试验中，使用Origin 9.0软件作图。Box-Behnken试验设计均采用Design-Expert 8.0.6软件进行数据处理分析。1.2.7 7 L发酵罐验证试验根据上述优化的最佳培养基成分和发酵培养条件进行7 L发酵罐放大验证实验，依据Box-Benhnken实验中3个显著因素，将初始葡萄糖浓度调整为30.0 g/L，黄豆饼粉浓度调整为15.0 g/L，调控转速，其他参数设置同摇瓶优化结果，监测发酵过程中各参数的变化。1.2.8 EPS活性的初步探索纳豆激酶活性研究该菌株EPS经提取发现具有纳豆激酶活性，测定方法纤维蛋白降解法参考高泽鑫2结果与分析2.1 目的菌株的确定经过筛选对比和分离纯化，获得目的菌株。通过菌落的形态学分析（如图1），呈乳白色，不透明，边缘呈不规则锯齿状，革兰氏阳性菌，有芽孢和伴孢晶体由上海生工公司进行16S rDNA测序，并在NCBI数据库上对比序列并结合生理生化实验，确定该菌株为苏云金芽孢杆菌(2.2 单因素实验结果2.2.1 不同碳源及碳源浓度对菌株EPS产量及生长的影响以基础发酵培养基中葡萄糖为对照，分别称取20.0 g/L的麦芽糖、蔗糖，果糖，半乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖作为碳源，分析考察碳源种类对菌株BT-IX17生长及所产EPS产量的影响。由图3-a可知，麦芽糖作为碳源时，EPS的产量最高为1.62 g/L，但麦芽糖这种原料经济成本较高。而以葡萄糖为碳源时，菌株生物量在确定葡萄糖为最佳碳源之后，对其浓度进一步