琥珀酸脱氢酶的提取与活力测定的研究进展.docVIP

琥珀酸脱氢酶的提取与活力测定的研究进展 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：琥珀酸脱氢酶的提取与活力测定的研究进展 1 1 琥珀酸脱氢酶的提取与生理意义 2 2 琥珀酸脱氢酶的常用测定方法 3 文2：山楂叶黄酮提取与测定研究进展 4 一、山楂叶黄酮的提取方法 5 （一）溶剂提取法 5 （二）微波提取法 5 （三）酶解法 5 90 min，总黄酮的提取率比常用方法提高了% 6 （四）超临界流体萃取技术 6 （五）超高压萃取技术 6 二、山楂叶黄酮的测定 6 （一）定性测定 7 （二）定量检测 7 三、山楂叶黄酮开发利用的问题与措施 9 参考文摘引言： 9 原创性声明（模板） 10 文章致谢（模板） 11 正文 琥珀酸脱氢酶的提取与活力测定的研究进展 文1：琥珀酸脱氢酶的提取与活力测定的研究进展 琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase，简称SDH），黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶，属膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标志酶。作为参与三羧酸循环的关键酶，琥珀酸脱氢酶是反映线粒体功能的标志酶（marker enzyme）之一，其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标[1]，对于评价精子线粒体功能、研究致奶牛酮缺乏症病理过程等具有重要意义[2～3] 本文从琥珀酸脱氢酶的提取、纯化、性质及其测定方法等几方面回顾并介绍了琥珀酸脱氢酶的研究进展情况。 1 琥珀酸脱氢酶的提取与生理意义 琥珀酸脱氢酶存在于所有有氧呼吸细胞，和线粒体膜牢固结合，是三羧酸循环中唯一与内膜结合的酶，是脱氢酶中最重要的酶。迄今为止，已从多种原核和真核组织中分离纯化出这种酶，为该酶的酶学研究奠定了基础。作为膜内酶，琥珀酸脱氢酶与具有脂双层结构的线粒体膜结合得比较紧密，很难溶解下来，而且其一旦离开膜后，暴露在空气中会很快失活，因此其提纯难度很大。1950年我国著名生物化学家王应睐、邹承鲁、汪静英等开展对膜蛋白琥珀酸脱氢酶的研究，经过反复实验最后以正丁醇抽提法成功地把琥珀酸脱氢酶从鼠肝组织线粒体膜上溶解下来，得到了高纯度的水溶性琥珀酸脱氢酶，其活力比同期国外报道者高出1倍以上，从而奠定了我国在琥珀酸脱氢酶研究领域的领先地位[4]。其后，Davis等（1971、1977）使用NaClO4从牛心线粒体溶解下此酶[5～6]；Tsukaho Hattori和Tadashi Asahi（1982）选用离子型去垢剂脱氧胆酸钠从番薯根线粒体提取SDH[7]；Suraveratum等（2000）对恶性疟原虫的琥珀酸脱氢酶进行了纯化[8]；夏玉凤等（2000）以玉米黄化苗为生物材料，通过差速离心获得线粒体，使用超声波将其破碎，用2%Triton X-100溶膜，超速离心，硫酸铵沉淀，DEAE-C32层析纯化琥珀酸脱氢酶[9]；辛明秀等（2004）用常规酶学方法从嗜冷酵母（Y18）中分离纯化出有催化活性的琥珀酸脱氢酶[10] 琥珀酸脱氢酶是直接连在电子传递链上的，氢受体是FAD而不是NAD＋，它使琥珀酸氧化为延胡索酸过程中所产生的FADH2与酶结合，将来自FADH2的两个电子直接传递给酶的Fe3＋[11～12]。现有研究表明，琥珀酸脱氢酶由α、β两个亚基组成，α亚基相对分子质量为×103，含有FAD和两个铁硫簇；β亚基相对分子质量为×103，含有一个铁硫簇[13～14] 2 琥珀酸脱氢酶的常用测定方法 琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种。 硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法[15～16] 琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等发生反应催化琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光度计检测即可加以定量反映，其反应式为：①Succinate＋PMS→Fumarate＋PMSH2；②PMSH2＋DCPIP→PMS＋DCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这种色泽可因其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化与DCPIP含量成正比，测定的还原速度可以推算出SDH的活力。一分子DCPIP被还原，即代表一分子琥珀酸被氧化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来 计算 SDH的活性。SDH活性计算：（标准－测定）/标准=μmol/mimg。 铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法 以铁氰化钾[K3Fe（CN）6]和琥珀酸钠为底物，使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6]，K4Fe（CN）6再与Fe3＋作