依达拉奉对Aβ140诱导PC12细胞NFκBBcl2mRNA和蛋白表达的影响临床医学.docVIP

依达拉奉对Aβ140诱导PC12细胞NFκBBcl2mRNA和蛋白表达的影响临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：依达拉奉对Aβ140诱导PC12细胞NFκBBcl2mRNA和蛋白表达的影响临床医学 1 1材资料与方法 2 2 结 果 3 3 讨 论 4 文2：MCI186减轻Aβ140诱导PC12细胞tau蛋白磷酸化的研究 6 1 材料与方法 6 2 结 果 8 3 讨 论 9 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 依达拉奉对Aβ140诱导PC12细胞NFκBBcl2mRNA和蛋白表达的影响临床医学 文1：依达拉奉对Aβ140诱导PC12细胞NFκBBcl2mRNA和蛋白表达的影响临床医学 阿尔茨海默病(AD)是老年人最常见的神经变性疾病,临床表现为进行性痴呆、认知障碍和行为异常。目前资料表明，AD的发生与氧化应激密切相关，氧化应激增加蛋白质氧化损伤和DNA氧化损伤，导致神经元死亡或功能失调，而这种缺失死亡以凋亡为主。 依达拉奉是新型的自由基清除剂，可以特异性清除羟自由基(OH)，抑制氧化应激及其继发的细胞凋亡，发挥神经保护作用，目前主要应用在脑梗死早期和脑出血的 治疗 中。临床发现依达拉奉对部分痴呆患者可能有改善症状的作用，提示依达拉奉是一种具有前途的治疗AD的药物。本实验通过Aβ140蛋白诱导损伤的PC12细胞建立AD细胞模型，探讨NFκB、Bcl2与神经细胞凋亡的关系，为进一步研究AD的发病机制及防治策略提供理论基础。 1材资料与方法 药品与试剂 PC12细胞购自 中国 生命 科学 院上海细胞所，Aβ140、NFκB引物、Bcl2引物、βactin引物、NC膜、TEMED购自北京鼎国生物公司,NFκB P65抗体、Bcl2抗体购自Sigma公司，DAB显色试剂盒购自博士德公司,依达拉奉购自江苏先声药业有限公司。 方法 细胞培养和预处理 用含有15%胎牛血清的DMEM培养基( g NaHCO3)，置于37℃，5% CO2孵箱中培养，每3天传代1次，传代时用机械方法吹打贴壁的PC12细胞，取生长期细胞用于实验。分为依达拉奉保护组(20 μmol/L 依达拉奉+Aβ140)，Aβ140模型组(30 μmol/L Aβ140)和对照组(正常PC12细胞) 。 目的基因mRNA的表达 Trizol法提取总RNA。紫外分光光度计测定RNA纯度及含量，28S/18S灰度比约为2∶1。 逆转录PCR(RTPCR)法 首先mRNA反转录合成cDNA第一链。以上述cDNA为模板，以βactin为内参照，分别对NFκB P65和Bcl2进行PCR扩增。大鼠βactin引物：上游引物：5′ATTTGCACCACACTTTCTACA3′，下游引物：5′TCACGCACGATTTCCCTCTCAG3′(扩增长度380 bp)。大鼠NFκB P65引物：上游引物：5′AAGATCAATGGCTACACAGG3′，下游引物：5′CCTCAATGTCTTCTTTCTGC3′(扩增长度493 bp)。大鼠Bcl2引物：上游引物：5′CTGGTGGACAACATCGCTCTG3′，下游引物：5′GGTCTGCTGACCTCACTTGTG3′(扩增长度441 bp) Western 印迹检测NFκB P65、Bcl2蛋白表达 常规蛋白质提取。采用bradford(1976)法进行蛋白质定量抗体结合，将封闭的膜浸泡在含有一抗的反应液中，37℃，2 h;将洗涤后的膜加入含有二抗的反应液中，37℃，2 h;TBST洗液15 ml洗膜，10 min×3次;显色照相：洗涤后的膜加入1 ml DAB显色液，显色10～30 min，用水漂洗终止显色，湿润密封4℃保存，待照相记录后，分析结果。 统计学分析 所有数据均采用x±s表示，应用统计软件对各组NFκB P65 mRNA和Bcl2 mRNA相对水平进行Studentt检验。 2 结 果 NFκB P65 mRNA和Bcl2 mRNA的表达 模型组中NFκB P65 mRNA表达水平明显升高，Bcl2 mRNA表达水平明显降低，与对照组比较有显著差异(P)，说明Aβ140能引起PC12细胞NFκB P65 mRNA表达上调，Bcl2 mRNA表达水平减低，促进细胞凋亡。保护组中NFκB P65 mRNA及Bcl2 mRNA表达与模型组相反，组间比较有统计学意义(均P)，而与对照组比较均无统计学意义(P)，说明依达拉奉能够下调Aβ140诱导分化P