舒洛地特对糖尿病大鼠肾脏转化生子因子β1与结缔组织生长因子表达的影响临床医学.docVIP

舒洛地特对糖尿病大鼠肾脏转化生子因子β1与结缔组织生长因子表达的影响临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：舒洛地特对糖尿病大鼠肾脏转化生子因子β1与结缔组织生长因子表达的影响临床医学 1 1 材料与方法 2 24 h尿微量白蛋白测定 2 2 结果 4 3 讨论 6 文2：舒洛地特对糖尿病肾病患者24h尿蛋白定量的影响 8 1 资料与方法 9 2 结果 10 3 讨论 11 参考文摘引言： 13 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 14 正文 舒洛地特对糖尿病大鼠肾脏转化生子因子β1与结缔组织生长因子表达的影响临床医学 文1：舒洛地特对糖尿病大鼠肾脏转化生子因子β1与结缔组织生长因子表达的影响临床医学 舒洛地特(sulodexide)对糖尿病肾病(DN)有保护作用，可减少蛋白尿，保护肾功能，但其确切机制尚不清楚。转化生长因子β1(TGFβ1)能促进系膜细胞合成和分泌细胞外基质(ECM),抑制ECM的降解；加速其积聚，是DN发生 发展 的重要机制〔1〕。结缔组织生长因子(CTGF)作为TGFβ1的下游因子，在DN时过表达，是DN发生的重要驱动因子之一。本研究拟在TGFβ1、CTGF水平进一步探讨舒洛地特治疗DN的作用机制，为防治DN提供一定的理论依据。 1 材料与方法 主要试剂和仪器 链脲佐菌素(STZ，Sigma)；放射免疫法测试大鼠尿微量白蛋白试剂盒(ADL公司)；日立7600生化分析仪；兔抗TGFβ1、CTGF抗体(武汉博士德生物有限公司)；抗体稀释液(Dako公司)；En Vision免疫组化试剂盒(广州基因有限公司)；BCA试剂盒(美国Pierce) 模型建立和分组 健康清洁级雄性SD大鼠35只，体重(200±20)g 〔由沈阳军区总 医院 实验动物中心提供，使用许可证：SYXK(军200701T)〕。适应性喂养1 w。1 w后随机取10只设为正常对照组，给予普通饲料，余25只给予高糖高脂饲料，喂养1个月后造模。造模前禁食12 h，然后以STZ 50 mg/kg 1次腹腔注射。72 h后大鼠眼眶采血测定空腹血糖。血糖＞ mmol/L为造模成功，共有20只成功，随机分为DN组和DN舒洛地特治疗组(D组)，各10只。D组给予舒洛地特10 mg/kg肌肉注射每日1次，共8 w。实验期间，大鼠自由饮水、进食，未使用胰岛素及其他降糖药。 24 h尿微量白蛋白测定 实验结束前48 h使用代谢笼收集24 h尿液，计24 h尿量。按照试剂盒说明书，采用放射免疫法检测24 h尿微量白蛋白。 血生化指标测定 采用内眦取血法取血1 ml放入EP管中，以3 000 min离心5 min后，将血清移入另一EP管中，采用日立7600生化分析仪检测血糖、血肌酐、血尿素氮。 计算 肾脏肥大指数 大鼠处死前称体重(BW)；以％戊巴比妥钠35 mg/kg腹腔注射麻醉，取双侧肾脏，分别称肾重(KW)，计算肾脏肥大指数=〔KW(g)/BW(g)〕×103。 肾脏病理检查 大体标本观察。光镜观察：采用10％福尔马林固定肾组织、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片后，进行HE及PAS染色，采用光镜进行病 理学 观察。半定量分析，每张切片随机选取10个视野，计算阳性面积的均值。 肾脏免疫组织化学检测 采用二步法，5 μm肾组织石蜡切片梯度脱蜡水化后，3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，PBS缓冲液( mol/L，)洗涤，正常兔血清封闭，依次加入TGFβ1抗体、En Vision标记Ⅱ抗，DAB显色，苏木精复染，树脂封片。肾脏CTGF检测方法同TGFβ1。在胞质或胞膜处有棕黄色或棕红色颗粒状物质沉积为阳性细胞。采用IMP2000图像分析系统，对图像进行灰度变换，使阳性面积与背景分开，进行自动测量。肾小球免疫组化TGFβ1、CTGF阳性面积测定：在光学显微镜计算机图像分析系统屏幕上，每例标本400倍镜下随机观察5个肾小球，分别计算每个肾小球TGFβ1、CTGF的阳性面积比值，即阳性面积/肾小球面积，取其平均值进行统计学分析。 Western印迹分析 各组取100 mg肾组织，置于1 ml裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂PMSF 100 μg/μl，aprotinin 1 μg/ml，leupeptin 1 μg/ml)中裂解，匀浆后冰浴30 min，然后离心20 min，提取组织蛋白，BCA法测蛋白浓度。取蛋白质上样100 μg，进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转移至聚氟乙烯膜上，封闭液封闭，加入1∶200稀释的TGFβ1抗体，4℃过夜。％TBST洗膜3次，ECL显影。以βactin的蛋白表达为参照。用Sci