基因工程基本原理第5章重组基因导入受体细胞.pptVIP

（藻红素 ） （链霉亲和素 ） （生物素 ） （2） 地高辛标记探针：地高辛与UTP中尿嘧啶的C5相连 dUTP 连接臂 地高辛 地高辛：异羟基洋地黄毒苷，强心素，拉诺辛，Cardiox，Cardoxin，Cedoxin （3） 荧光素标记探针：用荧光素标记核酸、抗生物素蛋白或抗地高辛抗体。 荧光物质异硫氰酸荧光素（黄绿色） 罗丹明（红色） 羟基香豆素（兰色） 3. 标记探针的方法 （1） 切口平移标记法 （2） 随机引物标记法 （四）物理方法介导DNA直接转化 （1）基因枪转化 （2）超声波介导转化 （3）激光微束穿孔转化 （4）显微注射 三、重组基因导入动物受体细胞 （一）转染法 （二）脂质体介导转化 （三）动物病毒介导转导法 第三节 重组子筛选 只有少数受体细胞能被导入重组DNA分子 例：大肠杆菌 108个大肠杆菌，转化效率10-6 只有100个细胞被转化 克隆子的筛选：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选（Screening）或选择(Selection)。 转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞。 重组子：含有重组DNA分子的转化子。如果重组子含有外源目的基因，又称为阳性克隆子或期望重组子。 一、遗传表型直接筛选 （一）利用载体选择性标记筛选转化子 抗药性标 插入失活筛选 插入表达筛选 α－互补法（蓝白斑筛选法） （二） 利用报告基因筛选植物转化细胞 （三） 利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 （四） 营养缺陷型检测法 （五） 形成噬菌斑筛选法 二、依赖于重组子结构特征分析筛选 三、核酸杂交分析 （一）分子探针：放射性探针、非放射性探针、标记探针的方法 （二）核酸探针杂交分析 四、免疫化学分析检测 （一） 抗体检测法 （二） 免疫沉淀测定法（Immunoprecipitation, IP） （三） 转译筛选法 五、PCR筛选法 一、遗传表型直接筛选 （一）利用载体选择性标记筛选转化子 1. 抗药性标记 氨苄青霉素 氯霉素 卡那霉素 四环素 链霉素 2. 插入失活筛选 3. 插入表达筛选 载体的选择性标记基因前链接一段附调控序列，插入式祸福调控序列后，其下游的筛选标记基因才能表达 。 IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 4. α－互补法（蓝白斑筛选法） 乳糖操纵子： IPTG α-互补：是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。 IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 显色剂：X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。 （二） 利用报告基因筛选植物转化细胞 （1）新霉素磷酸转移酶（NPT Ⅱ）基因 （2）潮霉素磷酸转移酶（HPT）基因 （3）氯霉素乙酰基转移酶（CAT）基因 （4）β—葡萄糖苷酶（GUS）基因 （5）荧光素酶（LUC）基因 （6）抗除草剂bar基因：抗草丁膦 （7）冠瘿碱合成酶基因 报告基因 (reporter gene)——是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 荧光素酶（LUC）基因 转入了萤火虫的荧光素酶基因能发光的烟草 (1) 萤光素 + ATP → 萤光素化腺苷酸（luciferyl adenylate） + PPi (2)萤光素化腺苷酸 + O2 → 氧萤光素 + AMP + 光 机理： GFP：绿色荧光蛋白 日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所） 美国科学家马丁?查尔菲（哥伦比亚大学） 钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校） 2008年诺贝尔化学奖： GFP标记的微管 将绿黄红荧光蛋白质植入鱼的DNA分子结构中 稳定表达表达GFP的CHO细胞 GFP转基因小鼠 （三） 利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 （1）胸苷激酶（TK）基因： （2）二氢叶酸还原酶（DHFR）基因 （3）黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（ XGPRT）基因： 胸苷（T）转换成TMP的基因 催化二氢叶酸还原成四氢叶酸 催化GMP生成 （四） 营养缺陷型检测法 （五） 形成噬菌斑筛选法 二、依赖于重组子结构特征分析筛选 （一） 快速裂解菌落鉴定分子大小：琼脂糖电泳，分析DNA分子大小 （二） 限制性核酸内切酶酶解分析：DNA酶切图谱 （三）核酸杂交分析 三、核酸杂交分析 基本原理：具有一定互补的两条核酸(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互