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六味地黄丸中丹皮酚的含量测定方案 一、设计背景 六味地黄丸由熟地黄、山药、山茱萸、牡丹皮、泽泻、茯苓等原料炮制而成，是世界各地广泛使用的古老中药，用于治疗腰痛、脱发、月经不足、脱发、治疗肾阴虚证等各种疾病。腰、膝酸痛。六味地黄丸作为中药方剂，已有上千年的历史，最早记载于宋代《孝儿要正之觉》钱毅著。大量研究表明，丹皮酚具有多种药理活性，广泛的应用使其已成为我国最受欢迎的商业中药方剂之一。其具有抗衰老、调节T淋巴细胞和细胞因子、治疗II型糖尿病、调节中性系统等功效。中药的治疗作用主要由多种成分共同作用，如果是要测定其中的一种生物活性成分物质，则需要设计方案来进行检测。利用高效液相色谱，能较好地反映中药中不同含量的质量信息。另一方面，由于中药的质量与其主要生物活性成分直接相关，因此在质量控制实践中，定量分析也是必不可少的。丹皮酚治疗显著降低血糖水平、机械性痛觉过敏、机械性痛觉过敏和热痛觉过敏。丹皮酚治疗还能提高运动神经和感觉神经的传导速度。组织病理学研究表明丹皮酚治疗可防止神经元损伤，降低脱髓鞘和白细胞浸润。丹皮酚是六味地黄丸中非常重要的一种药用生物活性物质。测定其含量可以为质量控制提供实验依据。 图1、丹皮酚化学式 二、设计依据 检测依据来自于《中国药典》（2020版）中有关于测定中药材中有关含量的要求。方法一是选用紫外分光光度计法来进行测定的话，首先要对其进行一个超声处理，这样做的话，其操作简单方便、而且提取时间也比较短，方便来进行操作，提取之后，用紫外分光光度计来进行检测，因为丹皮酚在特定的吸收光波长下，其吸光度比较大，测定的含量比较准确，受到其他物质的干扰会比较小。方法二是选用高效液相色谱法来进行测定，采用高效液相色谱法来测定的话，其测定结果更为准确，选取适当的固定相和流动相，想要提取的物质因为在所选取的两相之中的溶解度不一，随着不断的溶解吸解吸这一个过程，就可以来对想要的物质进行分离。用高效液相色谱法来进行检测也是选取超声来进行一个前处理，其结果精密度和准确度都很好。就这两种方法而言，用高效液相色谱法更优，所以选取高效液相色谱法。 三、设计方案 （一）仪器与材料 1.仪器 电子天平（cp224D，天平塞多利斯科学仪器有限公司）、高效液相色谱仪(HP1100系列四元泵、上海惠普有限公司）、水浴加热锅（HH-4恒温水浴锅，金昌实验仪器源头厂家），超声仪、胶头滴管、烧杯、移液管、容量瓶等。 2.试剂试药 丹皮酚对照品(中国药品生物制品检定所，纯度：96.2％)； 六味地黄丸样品，由实习单位提供(规格：0.18*360丸)； 甲醇（色谱纯）、水为去离子水，其他试剂均为分析纯。 （二）色谱条件 色谱柱：Shim-pack?VP-ODS柱(150×4.7mm,5μm) 甲醇－水（70：30） 色谱柱温：20℃ 进样室温度：室温 进样量：10μl 流速：1.0mi/min 检测波长为274nm 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长为274nm。理论板数按丹皮酚峰计算应不低于3500，相邻色谱峰的分离度均应大于1.59。 （三）溶液的制备 1.对照品溶液的制 取对照品丹皮酚适量,?精密称定,?加甲醇制成1ml含0.24mg丹皮酚的贮备液,?用刻度吸管精密吸取2.5ml该贮备液移置25ml容量瓶中,加甲醇使溶解并稀释至刻度,摇匀，制成每1mL含42μg的溶液,待用。 2.供试品溶液的制备 取供试品六味地黄丸20粒,捣碎研细混匀,取约0.4g,精密称定,放入有瓶口塞的锥形瓶中,再精密加入50%甲醇50mL,加塞密闭, 称定重量,超声处理(功率250W,频率33KHz) 45min, 放冷,再次称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀后滤过,取续滤液,待用。 3.缓冲溶液的制备 中国药典中所述六味地黄丸的配方为：熟地黄120g,?酒萸肉60g,?山药60g,?茯苓45g,?泽泻45g,?牡丹皮45g ，除牡丹皮外，处方中各味药按8∶4∶4∶3∶3的比例混合，捣碎研细混匀,取约0.4g,精密称定,放入有瓶口塞的锥形瓶中,再精密加入50%甲醇50mL,加塞密闭, 称定重量,?超声处理(功率250W,频率33KHz) 45min, 放冷,再次称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀后滤过,取续滤液，便制得不含牡丹皮的缓冲溶液。 （四）方法学考察 1.专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液及缓冲溶液，在上述色谱条件下，分别进样测定，结果应使测定对象丹皮酚相应保留时间处无干扰，即缓冲溶液在与丹皮酚对照品溶液相同保留时间处未见明显的色谱峰,说明分离良好,缓冲溶液无干扰。记录丹皮酚的保留时间，计算分离度，判定是否可以达到良好的分离效果。 2.线性关系的确定 分别取所配制的对照品贮备溶液（0.24mg/ml）：1.0ml、2.0ml、4.0ml、8