关于改进的碱裂解法大规模提取质粒DNA.docVIP

关于改进的碱裂解法大规模提取质粒DNA 文档信息 属性： Doc-03D0TK，doc格式，正文4843字。质优实惠，欢迎下载！ 说明： 作为医药学资料、临床医学资料的写作参考资料，提供解决怎么写及格式等相关问题。 适用： 作为文章写作的参考文献，解决如何写好实用应用文、正确编写文案格式、内容摘取等相关工作。 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：关于改进的碱裂解法大规模提取质粒DNA 1 1 材料和方法 2 2 结果与分析 3 3 讨论 4 文2：关于科学演示实验的改进的探索与思考 5 一、增设演示实验，创设问题情境。 6 二、改进演示实验，创设生活情境。 6 参考文摘引言： 7 原创性声明（模板） 8 文章致谢（模板） 9 正文 关于改进的碱裂解法大规模提取质粒DNA 文1：关于改进的碱裂解法大规模提取质粒DNA 质粒的提取作为分子生物学领域的一项基本操作技术，几乎每天都要用到。尽管现在质粒提取的试剂盒有很多，但是对于普通的实验室，特别是科研经费不够充分以及实验条件不够好的实验室，并不能实现每次都用试剂盒来大规模提取质粒。所以，采用的还都是萨姆布鲁克[1]所提出的经典提取方法。本研究是在经典的质粒提取方法的基础上进行了一些改进，能够在简陋的实验室大规模提取质粒DNA，该方法还克服了以往提取质粒方法的RNA等杂质污染和操作烦琐，且得到的质粒DNA的质量和纯度均符合实验的要求。 1 材料和方法 材料 载体和菌株 Ecoli系DH5α宿主菌株由本室保存;重组质粒pGenesil1(带有绿色荧光)和pGenesil3(带有红色荧光)为靶向IGF1和EGF受体基因的小干扰RNA的真核表达重组质粒由本室设计和晶赛公司构建和鉴定。限制性内切酶EcoR I 为Promega 公司产品;Sal I为NEW ENGLAND BioLabsinc产品;其他常规分装分子生物学试剂均购于武汉天源生物技术公司。 主要试剂 氨苄青霉素与卡那霉素购自华美生物工程公司;其它各种堂规化学试剂均为分析纯。溶液Ⅰ：10mmol/L TrisHCl，，50mmol/L EDTA， ;灭菌后，加入RNaseA至20ug/ml，4℃保存。溶液Ⅱ：1%SDS，/L NaOH;现配现用，2%SDS，/L NaOH母液等体积混均即可。溶液Ⅲ：与常规碱裂解法相同，/L醋酸钾，pH ，用醋酸调节pH值。灭菌后，4℃保存。 方法 质粒DNA的提取 常规提取方法主要按文献[1]进行，但提取得到的质粒DNA不用RNaseA消化。改进的质粒DNA大规模提取方法按如下步骤进行：① 挑单菌于带有Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇菌过夜，至OD值为，取 菌液 ependorf管中，12000g，离心30s，弃尽上清，再重复两次，每个ependorf管共收集菌;② 加入溶液Ⅰ600uL，漩涡振荡器振荡，振荡使菌体充分分散，室温放置5 min;③ 加入溶液Ⅱ600uL，轻轻颠倒ependorf管4～5次，使溶液充分混匀，置于冰上5 min;④ 加入溶液Ⅲ600uL，轻轻颠倒ependorf管4～5次，使溶液充分混匀，置于冰上15min;⑤ 12000g，4℃，离心15min;吸出上清，加入倍体积的异丙醇，轻轻颠倒振荡，充分混匀;⑥ 12000g，室温，离心15min;弃尽上清，加入70%的乙醇洗涤沉淀一次;⑦ 超净工作台吹干沉淀或真空干燥，加入75uL无菌水，溶解沉淀。 质粒DNA的电泳检测 采用琼脂糖凝胶电泳法[1]。制备1%琼脂糖凝胶，取2uL样品进行凝胶电泳检测。 质粒DNA的定量及杂质检测 采用分光光度计(751GW)法[2]。样品释稀20倍后，分别测定OD260和OD280值，若OD260/OD280，表明DNA中含有RNA杂质。若OD260/OD280 2 结果与分析 质粒DNA的电泳检测 实验中采用4842bp和5192bp的小质粒pGenesil1和pGenesil3的小质粒来检测改进的质粒提取方法的重复性和适用性。从图1可以看出，改进质粒提取方法的得率达到标准的常规方法，且质粒DNA质量好，主要以超螺旋形存在;质粒DNA杂质明显少于常规方法所提取的质粒;最主要的是在小提取质粒条件下，使用N个ependorf管可以一次性大规模提取质粒DNA;这种改进的方法同样可以适用大质粒的提取，并且得率比常规方法略高，解决了分子量大的质粒难以提取的难题。 质粒DNA的定量及杂质检测 采用常规与改进的碱裂解法提取的pGenecil1和pGenesil3质粒DNA，经分光光度计检测可知，改进方法提取质粒pGenecil1和pGenesil3的得率到达常规方法的水平，对于