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极低频率电磁场对离体肿瘤细胞的诱导凋亡作用 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：极低频率电磁场对离体肿瘤细胞的诱导凋亡作用 1 1 材料和方法 2 2 结果 3 3 讨论 4 文2：极低频率电磁场对离体肿瘤细胞的诱导凋亡作用 6 1 材料和方法 6 2 结果 8 3 讨论 9 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 13 正文 极低频率电磁场对离体肿瘤细胞的诱导凋亡作用 文1：极低频率电磁场对离体肿瘤细胞的诱导凋亡作用 现国内外许多学者都有应用磁场治疗肿瘤的报道，并取得一定的疗效。但磁场对于离体肿瘤细胞的作用及其原理的报道相对较少，本研究采用极低频率电磁场干预对数生长期的3种肿瘤细胞，并和正常生长条件下的肿瘤细胞相比较， 旨在了解磁场对体外生长肿瘤细胞增殖、分化的影响，为磁场治疗肿瘤提供实验性的依据。 1 材料和方法 实验材料 磁场来源 极低频率电磁场由武汉市海军工程学院提供（型号：DL—D03 由天津中环电工有限公司制造）。额定电压250V，单相频率50Hz，由可调变压器及电阻调节输出磁场强度。 研究对象 三种肿瘤细胞中HepG2由华中科技大学同济医学院附属同济医院肝外科实验中心提供，MG63和MCF7由本实验室保存。 主要试剂 胎牛血清和1640培养基为Hyclone公司产品。MTT、二甲基亚砜（DMSO）、Annexin－Ⅴ／FITC和PI、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、荧光显微镜、ELX800UV型酶标测试仪、流式细胞仪（同济医学院免疫教研室） 实验方法 肿瘤细胞生长形态观察 干预前及干预后72h，在相差显微镜下观察各组3种细胞的生长形态。 MTT (四甲基偶氮唑蓝)比色法测定细胞活力 将培养至第三代的3种细胞以％胰酶消化后，吹打制成单个细胞悬液（调整细胞密度为×104），分别接种5块到96孔板中。每块96孔板1～3列为不含细胞的血清，以消除血清物质对光吸收值的影响；4～6列为MG63细胞悬液；7～9列为MCF7细胞悬液；10～12列为HepG2细胞悬液。第1块96孔板为正常对照组，放置于37℃、5％CO2的培养箱；第2～5块板分别放置于37℃、5％CO2并含有磁场线圈的培养箱中。96孔板放于线圈的中央，通过调节变压器来达到预设的磁场强度。第2～5块96孔板的磁场强度分别为10mT、20mT、40mT、60mT，刺激时间为每天2次，每次持续1h。3天后每孔加入MTT溶液20μl，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃上清液，每小孔加入DMSO 150μl融解结晶物，振荡10min后在酶标仪上测定各孔的吸光值。 流式细胞仪检测各组3种肿瘤细胞凋亡的比例 磁场强度及磁场作用的时间和方法同前。磁刺激停止后，胰酶消化细胞并调整细胞浓度为1×106个/ml。取1ml细胞1000min 4℃离心10min，弃上清；加入1ml 4℃的PBS轻轻振荡使细胞悬浮，1000min 4℃离心10min后弃上清，重复本步骤共3次；将细胞悬浮于250μl的结合缓冲液中，取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin－Ⅴ／FITC和10μl PI溶液，混匀后室温避光孵育15min，在反应管中加入400μl的PBS后，流式细胞仪（FACS）检测分析。每组取5样本，每样本计数1×106个细胞，并计算其阳性率。在480nm的激发光下，检测3种肿瘤细胞凋亡细胞占细胞总数的比例。 统计学处理 实验结果以±s表示，采用SPSS 统计软件，应用单因素方差分析进行统计学处理。 2 结果 各组肿瘤细胞生长形态观察 干预后至72h， 磁场各组和对照组肿瘤细胞均有明显的生长，正常组细胞体积饱满，细胞密集；磁场组细胞体积较正常组小，密度稀疏，贴壁细胞脱落，凋亡上浮的细胞明显增多（通过预实验中收集3种贴壁生长细胞磁场干预72h后的细胞悬液进行流式分析） MTT (四甲基偶氮唑蓝)比色法测定细胞活力 在不同强度磁场刺激后各组的光密度值均数（OD值，±s）(见表1)和不同磁场强度对肿瘤的抑制率（见表2）。结果可见，在正常对照组，3种肿瘤细胞生长状态良好，其OD值均高于各磁场组；在各磁场组的 OD值均有不同程度的下降，其最大抑制率可达%（MG63，20mT组），其中MG63和MCF7均在20mT出现最大抑制率（分别为％、％），而HepG2在60mT出现最大抑制率（％）。经SPSS软件方差分析，各磁场组与对照组间差异有显著性意义（)。表1 三种肿瘤细胞OD值注：与正常组比较，*标记： P 流式细胞仪检测结果 对于流式细胞检测，本实验是基于MTT的结果上进行的，即在3种肿瘤细胞在MTT检测上出现最大抑制率的