长链非编码RNAlncRNAHCP5在三阴性乳腺癌中的作用及其机制.docVIP

长链非编码RNAlncRNAHCP5在三阴性乳腺癌中的作用及其机制 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：长链非编码RNAlncRNAHCP5在三阴性乳腺癌中的作用及其机制 1 1、资料与方法 2 2、结果 6 3、讨论 8 文2：NIS蛋白在三阴性乳腺癌中的表达 9 1 资料与方法 9 2 结果 11 3 讨论 12 参考文摘引言： 13 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 15 正文 长链非编码RNAlncRNAHCP5在三阴性乳腺癌中的作用及其机制 文1：长链非编码RNAlncRNAHCP5在三阴性乳腺癌中的作用及其机制 乳腺癌的发病率位居我国女性恶性肿瘤之首，而占比10%～17%的三阴性乳腺癌(TNBC)更是由于缺乏治疗靶点，而具有高侵袭性以及预后不良的特征[1]。因此，了解三阴性乳腺癌的发病机理，明确其疾病进展的相关机制对乳腺癌的预防和治疗具有十分重要的意义。 长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸但却没有蛋白编码能力的RNA转录本[2]。最新的证据表明，lncRNA参与了乳腺癌的发生发展[3，4]。HCP5是HLA和P5的复合物，主要在免疫系统细胞中表达，并在自身免疫中具有潜在作用[5]。最近的研究表明，HCP5在人类的一些癌症中表达异常。HCP5是与HCV相关的肝细胞癌的易感性位点[6]，它也被认为是肺腺癌的潜在生物标志物[7]，但是在卵巢癌患者中却显著下调[8]。通过共表达网络分析，我们发现HCP5与乳腺癌的预后息息相关[9]。然而，HCP5在TNBC中的作用机制尚未明确。本研究通过探讨HCP5在TNBC中的表达、功能和调控机制，为寻找新的TNBC治疗靶点提供理论依据。 1、资料与方法 细胞培养和临床组织样本 实验所需的人乳腺癌细胞系(MCF-7、T47D、SK-br-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453)和人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A均由中国科学院上海生物科学研究所提供。MCF-10A细胞系在F12/DMEM1∶1的培养基中进行培养。MCF-7细胞系在按比例加入/mL丙酮酸钠的MEM培养基中培养。T47D和SK-br-3细胞系使用DMEM培养基培养。以上所有细胞系均使用10%胎牛血清(FBS)在37℃和5%CO2培养箱中进行培养。而MDA-MB-231、MDA-MB-468和MDA-MB-453细胞系则使用含10%胎牛血清(FBS)的L-15培养基，在37℃、无CO2培养箱中培养。实验所需的临床组织样本为2014—2015年哈尔滨医科大学附属第三医院提供，其中包括30例浸润性导管癌(7例三阴、11例luminalA型、8例luminalB型和4例Her2+型)和30例浸润性导管癌的癌旁正常乳腺组织。上述所有组织的提供者在术前均未接受过放疗、化疗及免疫治疗，亦未合并其他恶性肿瘤。实验方案也获得了哈尔滨医科大学人类研究伦理委员会的批准。 基因敲除和慢病毒转染 将MDA-MB-231(1×105)和MDA-MB-468(2×105)细胞分别接种在6孔板中，24h后使用Lipofectamine2000试剂转染50nM的siRNA。将含有细胞的6孔板按照浓度梯度分别加入适量的慢病毒后再加入1/1000的聚丁二烯增强转染效果。HCP5siRNA的序列为5-GCAGTGTGCTTC-CTTCCTT-3。阴性对照组(NC)siRNA序列为5-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 细胞RNA提取和荧光定量PCR 荧光定量PCR检测人乳腺癌细胞系(MCF-7、T47D、SK-br-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453)和人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中HCP5mRNA的相对表达。首先使用TRIzol试剂提取细胞总RNA。提取出来的RNA用核酸测量仪测量其浓度，其次利用ReverTraAce-αqPCRRT试剂盒对RNA进行逆转录，合成cD-NA。采用miRcute第一链cDNA合成试剂盒对成熟的miRNA进行RT-PCR检测。然后根据SYbrGreenRT-PCR试剂盒操作，在ABI7500仪器上进行qRT-PCR扩增。以GAPDH为内参基因，所有样品进行3次独立重复性试验。本研究引物序列如下:HCP5-F:5-GACTCTCCTACTGGT-GCTTGGT-3，HCP5-R:5-CACTGCCTGGT-GAGCCTGTT-3;GAPDH-F:5-CGTCACGGAT-TIGGTCG-3，GAPDH-R:5-TCICGCTC-CIGAGGGGGAT-3。最后用比较值2-△△CT法对qRT-PCR结果进行分析。