牵张力作用下定量分析小鼠颅骨缝牵张成骨新骨形成的研究.docVIP

牵张力作用下定量分析小鼠颅骨缝牵张成骨新骨形成的研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：牵张力作用下定量分析小鼠颅骨缝牵张成骨新骨形成的研究 1 1、材料与方法 2 2、结果 4 3、讨论 5 文2：小鼠肾发育中CalbindinD28k的定量分析 6 1 材料和方法 7 2 结果 9 3 讨 论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 牵张力作用下定量分析小鼠颅骨缝牵张成骨新骨形成的研究 文1：牵张力作用下定量分析小鼠颅骨缝牵张成骨新骨形成的研究 颅骨缝是颅面骨骼重要的活跃生长区，其发育异常常导致颅颌面畸形及颌骨功能紊乱，极大影响患者的美观和身心健康[1]。骨缝牵张成骨术在临床中广泛应用于颅颌面畸形的矫治[2]。颅骨缝改建规律对治疗效果有极大影响[3]，至今对颅骨缝牵张后新骨形成与改建机制仍未完全阐明。以往对于骨缝牵张成骨的研究多着眼于组织学表现[4]，对于Micro CT分析报导相对较少[5]。本研究运用C57BL/6J小鼠构建颅骨缝牵张模型，利用Micro CT的高分辨率和直观性的优点[6]，还原骨缝牵张成骨过程并对骨骼参数进行全面深入的定量分析，同时结合组织学方法对新生骨进行观察，以明确颅骨缝牵张成骨的骨形成过程，对临床寻找合理治疗方法促进颅骨缝生长改建有重要意义，并为进一步深入研究奠定实验基础。 1、材料与方法 主要试剂与仪器 用于制作牵张加力器的直径英寸的澳丝(AJ Wilcock Pty Ltd，澳大利亚);Micro CT(SCANCO，瑞士);石蜡包埋机(Leica，德国);全自动半薄轮转切片机(Leica，德国);组织自动脱水机(Leica，德国);HE染液(碧云天，中国) 实验动物及分组 选取30只无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级4～5周龄健康雄性C57BL/6J小鼠，购自南京医科大学实验动物中心，经检查颅顶饱满无明显畸形，随机分为颅骨矢状缝假手术对照组与牵张加力组，每组15只。每组随机分为3个小组，每小组5只，分别在牵张7、14、28 d后处死。 加力器的设计及制作 本实验运用由直径英寸的澳丝弯制的加力器。每条加力臂压缩2 mm回弹后可产生每侧约20 g的扩展力。 实验方法 所有小鼠均用%水合氯醛进行腹腔麻醉( mL/100 g体重)。颅顶处备皮，术区消毒，剪开头皮暴露矢状缝，小心去除骨缝周围结缔组织。作矢状缝的垂直平分线，线上距离矢状缝 mm处对称标记两点，用7号针针头小心戳出小孔。加力组加力器两臂间距离11 mm，压缩至距离为7 mm置入小孔，释放加力臂产生扩张力。对照组加力器两臂间距离7 mm，被动插入小孔。安装完毕后缝合头皮并消毒术区(图1)。实验方法已通过南京医科大学动物实验伦理委员会审核。实验伦理编号:IACUC- 图1小鼠矢状缝牵张模型建立 在牵张7、14和28 d后分别处死各组小鼠并收集其颅骨，在牵张加力器在位的情况下用圆规、直尺测量其两臂间直线距离。 牵张7、14和28 d后的小鼠颅骨收集后于4%多聚甲醛中固定12 h，去除加力器后行Micro CT扫描，分辨率为μm。所得数据首先用DataViewer软件进行头位调整，使所有颅骨均为脑组织面朝下，枕骨朝后;使用CT Vox软件进行图像重建;使用CTAn软件，在所有颅骨矢状缝冠状向上以所打两孔连线为基准，分别向前和向后μm×μm的矩形各截取5层图像进行骨骼参数分析(图2) 图2 ROI区域选择及其截面示意图 将甲醛固定后的颅骨标本流水冲洗过夜，置于10%乙二胺四乙酸二钠盐溶液(EDTA)中脱钙2～3周，逐级脱水石蜡包埋，5μm切片，55℃恒温烤片2 h后行染色，显微镜下观察矢状缝组织学变化。 所有数据均用xˉ±s的形式表示，并使用Graphpad Prism 软件进行统计分析，同一时间点实验组和对照组的比较采用t检验，不同时间点对照组或实验组之间的比较采用单因素方差分析，以P具有统计学差异。 2、结果 所有实验小鼠均顺利完成颅骨缝牵张手术并且在实验过程中牵张加力器没有脱位。牵张加力组小鼠和同期对照组小鼠矢状缝相比较被显著扩大(P) 实体标本观测 牵张加力实验组牵张7 d后，牵张区主要为纤维组织，质地柔软，颜色透明。牵张14 d后，牵张区纤维组织范围减小，新骨组织形成，颜色浑浊，向中央纤维组织区延伸，呈锯齿状交织。牵张区硬度增加。牵张28 d后，纤维组织范围进一步缩小，新骨组织增加，逐渐充填牵张区，牵张区硬度显著增加。牵张7 d后所打两孔间距离和同期对照组相比显著增加()。见表1。 表1实体标本检测所打两孔间距离 Micro CT观察(图3)