关于3株PEDV的S基因核苷酸序列及蛋白氨基酸序列的研究.docVIP

关于3株PEDV的S基因核苷酸序列及蛋白氨基酸序列的研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：关于3株PEDV的S基因核苷酸序列及蛋白氨基酸序列的研究 1 1、材料与方法 2 2、结果 4 3、讨论 6 文2：关于脑出血患者血清S100β蛋白与神经元特异性烯醇化酶的检测及意义 7 1 资料与方法 8 2 结果 9 3 讨论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 12 正文 关于3株PEDV的S基因核苷酸序列及蛋白氨基酸序列的研究 文1：关于3株PEDV的S基因核苷酸序列及蛋白氨基酸序列的研究 猪流行性腹泻病毒是冠状病毒科冠状病毒属的成员，主要引起患病猪的肠道绒毛萎缩，脱水和腹泻等症状[1]。通常PEDV被认为是食源性和水源性病原体，主要通过粪-口途径传播，近年来发现，PEDV也可以通过气溶胶传播[2]。1980年中国首次分离到PEDV，但并未引起较大经济损失，自2010年末，中国养猪场出现了对仔猪具有较高毒力的PEDV变异株，1周龄以下仔猪感染后的病死率高达100%[3]，并迅速蔓延至国内大部分猪场，给我国养猪业造成了严重的经济损失[4] PEDV是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约28kb，包含5非翻译区(UTR)，3UTR，至少含有7个开放阅读框(ORFs)，编码纤突(S)、囊膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)4种结构蛋白和3种非结构蛋白，分别为复制酶1a、1ab和ORF3，它们以5UTR-ORF1a/1b-S-ORF3-EMN-3UTR的顺序排列。2个长的ORF区ORF1a和ORF1b，占据基因组的2/3，2个非结构蛋白pp1a和pp1b，负责基因组的复制、转录和病毒的蛋白加工[5]。PEDV基因组遗传衍化分析发现，S基因为高变区，其变异在一定程度上代表了整个基因组的变异特征，并且冠状病毒属的S蛋白发生变异会导致其宿主范围、组织细胞培养及毒力发生改变，不同来源分离株的S蛋白之间存在氨基酸插入、突变等现象，进而改变病毒原始抗原特性[6]。因此，对PEDVS基因进行遗传变异分析，对于PEDV的研究及防控具有重要意义。 目前疫苗接种是预防PED的主要手段，然而免疫接种经典毒株疫苗的猪场也常有发病。通过对2010年以来PEDV流行毒株分子流行病学调查发现，流行毒株较经典毒株毒力基因已发生了较大改变。由此推测是造成经典毒株CV777病毒对猪场保护力不足及免疫失败的主要原因。因此，选择当前流行毒株制备疫苗是防控PEDV的关键。 本研究旨在对实验室从临床分离鉴定的3株PEDV进行S基因进行克隆，运用DNAMan和软件对克隆到的S基因核苷酸序列及蛋白氨基酸序列进行序列分析，以了解这些毒株的S基因遗传变异特点，丰富我国PEDV毒株信息，以期为PEDV的疫苗研发及防控提供参考。 1、材料与方法 材料 Trizol试剂，Invitrogen公司产品;一步法cDNA反转录试剂盒，北京TIANGEN公司产品;DNAMarkerDL2000，EXTaq酶，pMD19-T载体，TaKaRa公司产品;质粒提取试剂盒，南京诺维赞公司产品;琼脂糖，Invitorogen公司产品;其他试剂均为国产分析纯。 PEDVJX18、SD18和JingTai18分离株，均为中国农业科学院兰州兽医研究所猪禽消化道感染与黏膜免疫团队分别从江西省、山东省和甘肃省景泰市某规模化养猪场送检材料中分离并鉴定。 移液器、离心机，德国Eppendorf公司产品;核酸电泳仪、凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司产品;梯度PCR仪(TP350)，日本TaKaRa公司产品。 方法 采用Oligo7引物设计软件设计扩增S基因的引物，序列信息见表1，由西安擎科生物技术有限公司合成。 表1PCR引物信息 吸取200μL病毒培养液，用Trizol法提取RNA，根据试剂盒说明进行反转录操作。将得到的cDNA进行PCR扩增。反应体系如下:模板5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，EXTaq酶25μL，H2O18μL。反应条件:95℃3min;95℃30s，56℃30s，72℃2min30s，共30个循环;72℃5min。反应结束后吸取50μL进行20g/L琼脂糖凝胶电泳。对目的基因进行胶回收，并连接到pMD-19T载体上，1μLpMD-19T载体，4μL回收产物，5μLSolutionⅠ。进行16℃过夜连接，并将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，挑取单克隆，进行PCR鉴定。鉴定成功后交由西安擎科公司进行测序。 将测序得到的序列用SeqMan软件进行拼接，运用EditSeq软件将核苷酸序列翻译成蛋白质序列，并与PEDV经典毒株CV777进行比对分析，并