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循环肿瘤DNA在胰腺癌诊疗中的应用及前景 胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤，在男性和女性中的死亡率分别为4.9%和4.2%，并呈逐年增加趋势，这与胰腺癌早期诊断难、易转移、对当前治疗方案的敏感性较差及自身的组织学特征有关。近年来随着精准肿瘤学的快速发展，基因组图谱结果指导了越来越多癌症类型的个体化治疗。尽管高度异质的胰腺癌表现出独特的体细胞改变和特征性的驱动基因及突变，但由于胰腺解剖位置较深，组织活检及取材困难，且患者依从性低而无法进行检测。与胰腺癌组织活检相比，循环肿瘤 DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)作为一种非侵入性生物标志物用以揭示肿瘤特异性、个体突变及甲基化谱等遗传和表观遗传学改变，在胰腺癌的早期诊断、治疗评估、动态监测及预后评价方面显示出一定优势，因而近年来备受关注。本文就ctDNA在胰腺癌诊疗中的研究进展进行综述。 一、ctDNA 的特征 体液中的循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）指在血液无细胞成分中发现的降解DNA片段。cfDNA在细胞正常状态少量分泌，在细胞损伤或坏死时分泌增加。ctDNA在血液中的含量极低，仅占血液cfDNA的0.01%，长度范围为90～250 bp，比常规cfDNA片段短。与肿瘤组织相比，血浆样本中肿瘤DNA的丰度相对较低，这对基于血浆的检测灵敏度提出了一定挑战。ctDNA既可以由坏死或凋亡的原发性、转移及循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)释放，也可以通过正常肿瘤细胞主动分泌外泌体和前体胞外小泡等途径释放。由于肿瘤相关基因突变的存在，ctDNA可以有效地与正常cfDNA区分开来。与单个肿瘤组织样本相比，ctDNA水平受肿瘤内异质性的影响较小，能够提供患者肿瘤细胞更全面的基因组信息，包括编码区和非编码区、微卫星位点、杂合缺失、突变、多态性、甲基化和拷贝数变异。此外有研究发现ctDNA可以作为驱动肿瘤转移的信号分子参与肿瘤的发生和转移。一项研究将鼠NIH3-T3细胞与含有KRAS基因突变ctDNA片段的大肠肿瘤患者的血浆一起温育，随后注射到小鼠体内，可以观察到小鼠大肠肿瘤的发生和转移，并在小鼠血浆中检测到KRAS基因突变ctDNA片段。这表明通过监测ctDNA不仅可以监控肿瘤发生和转移，并有作为抑制肿瘤转移靶点的可能性。基于这些特征，ctDNA成为目前液体活检中常用的血源性标志物之一。 与胰腺癌组织活检相比，ctDNA测序具有明显的优势。(1)采集外周血液获得ctDNA是微创操作，可以降低患者痛苦和并发症发生率，而且不受部位的影响；(2)可以在治疗过程中的任何时候采集血液，实时和动态地监测肿瘤的分子变化，不依赖于侵入性组织活检和影像学检查；(3)通过对ctDNA的监测可以发现影像上不明显或不确定的胰腺癌组织，例如切除后残留的胰腺癌组织；(4)ctDNA可能代表了胰腺癌肿瘤的整个分子图像，可以揭示肿瘤特异性、个体突变及甲基化谱等遗传和表观遗传学改变。 与胰腺癌常见血液肿瘤标志物及液体活检指标相比，ctDNA测序具有很好的灵敏度和特异度。CA19-9作为最常见的胰腺癌肿瘤标志物，灵敏度仅为70%～89%，特异度为68%～91%。有研究发现CA19-9在Lewis血型阴性表型患者容易出现假阴性，而在阻塞性黄疸患者中常表现为假阳性。此外，良性肿瘤、炎症性肿块和糖尿病患者CA19-9的水平也会增加，因此目前对于CA19-9水平变化的解释及其在胰腺癌患者治疗中的作用还未达成共识。而利用二代测序技术检测ctDNA 基因突变灵敏度可以达到91%，特异度为100%。CTC作为另外一种正在发展的液体活检技术，在胰腺癌的诊断和检测效果并不理想，究其原因，一方面胰腺癌具有致密的间质细胞，肿瘤细胞占比仅为30%，常常在疾病晚期才会有更多的CTC；另一方面CTC在释放后失去了原始免疫抑制微环境的保护，更容易受到免疫细胞的攻击，故灵敏度低于ctDNA。 二、ctDNA的检测方法? 由于ctDNA在血液中的含量低，且片段小，高度可变，因此对其检测要求较高，特别是在ctDNA含量更少的肿瘤发展早期阶段。通过液体活组织检测肿瘤发生通常有两类方法，一类方法是检测原发肿瘤中已知的单个或少数肿瘤特异性突变来监测外周血液中的残留疾病，这类技术以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)为基础，包括定量PCR(quantitative ?polymerase chain reaction,Q-PCR)、癌症个体化深度测序分析方法(cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)和等位基因特异性PCR（ allele specific PCR