目的基因的克隆与基因文库的构建精美生物医学.pptVIP

基因：是具有遗传效应的DNA片段。 请你找找看…… 什么是基因文库，由哪两部分组成呢？ 构建基因文库由什么用呢？ 构建一个基因文库都有哪些基本步骤，请概括！ 基因：是具有遗传效应的DNA片段。 一．基因文库概述 1、概念 基因文库 (library)：一套包含某生物体 所有基因的DNA序列。 这些序列分别与适当的载体结合在一起。 载体：是介导小分子物质转运的另一类膜蛋白，它具有特异性。 2、基本组成 包括：基因组文库、cDNA文库 cDNA：由mRNA逆转录的DNA，因此不 含非转录的基因组序列。 单链cDNA可由DNA聚合酶转变成双链，应用于基因工程。 基因组文库 Genomic DNA library 使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的基因组DNA切割成许多片段 将所有片段连接到载体上，构成一个重组DNA群体 这个群体包含全基因组的遗传信息 载体：是介导小分子物质转运的另一类膜蛋白，它具有特异性。 群体：是根据研究目的所确定定的研究对象的全体，大量的研究表明在一个患者群体内药动学参数存在很大变异体。 群体：是根据研究目的所确定定的研究对象的全体，大量的研究表明在一个患者群体内药动学参数存在很大变异体。 遗传：生命有机体在生殖过程中表现出来的亲子代之间的相似现象。 cDNA文库（ cDNA library ） 以mRNA为模板，经反转录酶合成互补 DNA(complementary DNA，cDNA) 将双链cDNA与适当载体连接 转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNA文库 细胞：是一切生物的形态结构和功能活动的基本单位；是构成生物有机体的基本结构单位；是代谢与功能的基本单位；是生物有机体生长发育的基本单位；是遗传的基本单位。 基因组文库与 cDNA文库的比较： 基因组文库包含基因组的所有基因 cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列 分离特定基因，cDNA库比较方便 研究调控序列，必须用到基因组文库 细胞：是一切生物的形态结构和功能活动的基本单位；是构成生物有机体的基本结构单位；是代谢与功能的基本单位；是生物有机体生长发育的基本单位；是遗传的基本单位。 3、构建目的 创建基因文库的目的：从特定的材料中分离目 的DNA片段或基因。 把所有的基因集中在一个库中，采用一定的方法在库中筛选目的基因。 同时也便于基因的长期保存。 4、 基因文库的构建流程 （1）基因组文库的构建 提取某生物 全部DNA 用适当 限制酶切割 许 多 DNA片段 与载体连接 导入受体菌群 该生物基 因组文库 （每个受体菌含有一段不同的DNA片段） （2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成 mRNA 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA DNA聚合酶 双链DNA 与载体连接 导入受体菌群 该生物 cDNA文库 杂交：两个基因型不同的个体相交。 5、基因文库的质量标准 尽可能高的完备性 重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选 克隆：通过无性方式，由单个细胞或个体产生的、和亲代非常相似的一群细胞或生物体。 克隆：通过无性方式，由单个细胞或个体产生的、和亲代非常相似的一群细胞或生物体。 二、目的基因的克隆 　用限制酶切断成许多片段 1、直接分离法—“鸟枪法” 载入运载体 导入不同的受体细胞 大量复制和表达 找出含有目的基因的细胞 限制酶将DNA切成许多片段 鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构 结构：群落中所有生物及其个体在空间的配置情况 内含子：（introns）是真核生物细胞DNA中的间插序列。这些序列被转录在前体RNA中，经过剪接被去除，最终不存在于成熟RNA分子中。内含子和外显子的交替排列构成了割裂基因，在前体RNA中的内含子常被称作“间插序列”。 2、人工合成基因法： 1）逆转录法： mRNA 双链DNA (即目的基因) 逆转录酶 单链DNA 合成 2）直接合成法： 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因（双链） 化学合成 氨基酸：是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物，氨基一般连在α-碳上。 结构：群落中所有生物及其个体在空间的配置情况 结构基因：编码mRNA分子的基因。 3、通过DNA合成仪直接合成目的基