果蔬中苯丙氨酸解氨酶活性的测定.pdfVIP

果蔬中苯丙氨酸解氨酶活性的测定 一、目的要求 学习果蔬组织中苯丙氨酸解氨酶活性的测定原理和方法。 二、基本原理 苯丙氨酸解氨酶 （Phenylalamineammonialyase，PAL）是许多植物次生物质 （如黄酮类物质、酚类物质、木质素和水杨酸等）生物合成途径——苯丙烷代谢 的关键酶，与植物的抗逆境胁迫和抗病性密切相关，在植物的正常生长发育和抵 御病原菌侵害过程中起着重要作用。 测 PAL 催化 L-苯丙氨酸裂解脱氨反应，形成的产物反式肉桂酸化合物 （trans-cinnamic acid）在290nm 处有最大光吸收值。该酶活性的变化可以根据 检 其催化形成的产物反式肉桂酸在290nm 吸光度值变化进行测定。在1cm 光程下 当吸光度值变化0.01，就有 1µg 反式肉桂酸量的变化。若酶的加入量适当，反 质 应体系在波长290nm 处吸光度值的升高速率可在几小时内保持不变。 三、材料、仪器及试剂 （一）材料 液 梨、苹果、马铃薯。 （二）仪器及用具 测 海 高速冷冻离心机、研钵、紫外分光光度计、计时器、移液器、离心管、容量 瓶 （100mL、20mL、1000mL）、试管、水浴锅。 上 （三）试剂 检 1．100mmol/L、pH 8.8硼酸缓冲液 母液A （50mmol/L硼砂溶液）：称取19.07g 硼砂 （十水合硼酸钠），用蒸 质 馏水溶解、定容至1000mL。 母液B （200mmol/L 硼酸溶液）：称取 12.73 g 硼酸，用蒸馏水溶解、定容 至1000mL。 液 取66.67mL 母液A 和33.33mL 母液B 混合后，调节pH 至8.8，稀释至200 mL。 海 测 2．50mmol/L、pH 8.8硼酸缓冲液 3．提取缓冲液 （含4%PVP、2mmol/LEDTA 和5mmol/Lβ-巯基乙醇） 上 检 取4 gPVP、58mgEDTA，35 µLβ-巯基乙醇，加100mmol/L、pH 8.8硼酸 缓冲液溶解、定容至100mL，低温 （4℃）保存备用。 4．20mmol/LL-苯丙氨酸溶液 质 称取330mgL-苯丙氨酸，用50mmol/L、pH 8.8硼酸缓冲液溶解、定容至 100mL。 液 5．6mol/L 盐酸溶液 取10mL 浓盐酸溶液，稀释到20mL。 海 四、实验步骤 （一）酶液制备 称取5.0g 果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL 提取缓冲液，在冰浴条 上 件下研磨成匀浆。将匀浆液全部转入到离心管中，于4℃、12 000×g 离心30min，