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果蔬中几丁质酶活性的测定 一、目的要求 了解植物体内几丁质酶的作用，学习果蔬组织中几丁质酶活性的测定原理和 方法。 二、基本原理 植物在受病原物侵染时，常产生一些病程相关蛋白 （Pathogensis-related proteins ，PR 蛋白）以抵御病原菌的进一步侵染。几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶便 是两类重要的PR 蛋白。高等植物体内广泛存在几丁质酶，能降解多种真菌细胞 测 壁的主要成分—几丁质，从而对病原菌生长具有直接的抑制作用。辣椒、芒果、 梨、柑橘等果蔬的采后抗病性与这两种酶的活性密切相关。许多生物因子和非生 检 物因子如采后热处理、抗病诱导制剂处理都能诱导果蔬几丁质酶和β-1,3-葡聚糖 酶活性升高，从而提高果蔬采后抗病性，抑制病害的发生。 质 几丁质酶主要水解几丁质多聚体中的β-1,4-糖苷键，依据水解口位置的不同 可分为内切几丁质酶和外切几丁质酶。几丁质酶催化几丁质水解形成的产物为 N- 乙酰葡萄糖胺 （Glc-NAc ）单体。通过利用二甲氨基苯甲醛测定几丁质酶催化 液 的水解过程中产生的Glc-NAc 的生成量可以反映几丁质酶的活性。 三、材料、仪器及试剂 测 海 （一）材料 梨、番茄、芒果、香蕉等。 上 （二）仪器及用具 检 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、水浴锅、 具塞刻度试管 （25 mL ）、容量瓶 （100 mL、1 000 mL ）。 质 （三）试剂 1．100 mmol/L、pH 5.2 醋酸缓冲液 液 母液A （200 mmol/L 醋酸溶液）：量取11.55 mL 冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000 mL 。 母液B （200 mmol/L 醋酸钠溶液）：称取16.4 g 无水醋酸钠 （或称取27.2 g 测 海 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解后定容至1 000 mL 。 取105 mL 母液A 和395 mL 母液B 混合后，调节pH 至5.2 ，稀释至1 000 mL ， 上 检 即为100 mmol/L、pH 5.2 醋酸缓冲液。 2 ．提取缓冲液 称取29 mg EDTA ，吸取35 µL β-巯基乙醇，加入到100 mmol/L、pH 5.2 醋 质 酸缓冲液中，定容至100 mL ，摇溶，即得提取缓冲液 （含1 mmol/L EDTA 和5 mmol/L β-巯基乙醇），低温 （4℃ ）贮藏备用。 液 3 ．50 mmol/L、pH 5.2 醋酸缓冲液 4 ．胶状几丁质 （10 mg/mL ）制备 海 称取1.0 g 几丁质 （Sigma 产品），加入4 ml 经4℃预冷的丙酮在冰浴、通风 条件下充分研磨，期间可适量加入丙酮，应充分研细。然后边研磨边缓缓加入