果蔬同工酶和可溶性蛋白质凝胶电泳.pdfVIP

果蔬同工酶和可溶性蛋白质凝胶电泳 一、目的要求 了解同工酶的作用及意义，学习利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离果蔬组织中可 溶性蛋白质和进行同功酶检测的方法。 二、基本原理 同工酶 （Isoenzyme）是指能催化同一种化学反应，但其分子结构不同的一 组酶，它和其他种类的蛋白质一样，都是DNA 编码的遗传信息表达的产物。在 果蔬的生长发育、成熟衰老的各个阶段，组织中的同工酶并不相同。同工酶的合 测 成还受果蔬组织或器官的形态特征、发育来源和生长环境条件的影响。因此，在 研究果蔬基因表达调控以及许多生理遗传问题时，常常要分析可溶性蛋白质和同 检 工酶变化，这在理论和实践中都具有十分重要的意义。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离可溶性蛋白质和分析同功酶变化，方法简便，灵敏度高，重现性强，结果便 质 于观察、记录和保存。 根据同工酶能催化同一种化学反应的特点，在样品中可溶性蛋白质经电泳分 离之后，再在合适条件下进行专一活性的染色，就可以观察到不同的同工酶谱带。 液 三、材料、仪器及试剂 （一）材料 测 海 苹果、梨、番茄等果实；菠菜、香菜等蔬菜。将材料洗浄去除表面土粒和灰 上尘待用。 检 （二）仪器及用具 电泳仪1套 （稳压电源、垂直电泳槽和相配套的凹槽玻璃）、台式高速离心 质 机、水浴锅、离心管、移液器 （5mL、1000 μL、100 μL、50 μL）、烧杯若干 （100 mL、50mL）、容量瓶 （1000mL、100mL）、研钵、玻璃棒、滤纸、20mL 培养 皿2 个 （或用白瓷盘代替，染色用）、海绵块、摇床、镊子。 液 （三）试剂 1．30%丙烯酰胺 （ACr，未纯化的试剂，配制后需过滤） 测 海 2．1%甲叉双丙烯酰胺 （BIs） 3．10%的过硫酸铵 （AP，冰箱贮藏，不得超过5 天） 检 4．分离胶缓冲贮备液（3mol/L Tris-Hcl，pH8.8）：称取36.6gTris溶于30mL 上 蒸馏水和48mL 1mol/LHCl 中，调节pH 至8.8，定容至100mL。 5．浓缩胶缓冲贮备液 （0.5mol/LTrIs-HCl，pH6.8）：称取6.0gTris溶于40 质 mL 蒸馏水和48mL 1mol/LHCl，调节pH 至6.8，定容至100mL。 6．电极缓冲液 （0.25mol/LTris，1.92mol/L甘氨酸，pH 8.3）：称取3gTris、 液 14.4 g甘氨酸，溶于重蒸馏水并定容至100mL，使用时稀释10倍。 7．N,N,N′,N′－四甲基乙二胺 （TEMED） 8．提样缓冲液：稀释4 倍的浓缩胶缓冲液。 海 9．样品处理液：分别取10mL 50%甘油，0.5mL