3-5-环腺苷酸磷酸二脂酶（PDE）的提取与CaM活性的测定.pdfVIP

3-5-环腺苷酸磷酸二脂酶 （PDE）的提取与CaM 活性的测定 3-5-环腺苷酸磷酸二脂酶 （以下简称PDE）是环核苷酸代谢中的重要酶。PDE 有多种形式、 2+ 其中主要的有两种：一种为依赖Ca 的PDE，可被CaM 激活，是经典的CaM 靶酶之一；另一 2+ 种为不依赖Ca 的PDE，不被CaM 激活。这里介绍的为前一种。由于PDE 活性与CaM 含量成 剂量关系，所以成为最常用的检测CaM 活性和定量活性CaM 的方法。 PDE 提取过程中用盐析法沉淀蛋白质后，通过 DEAE-纤维素柱梯度洗脱法分离PDE。其原 理是，在0～0.4mol/LNaCI 浓度范围内，CaM 不能被洗脱，而PDE 则可以，从而获得无CaM 且具有一定基础活性的PDE。PDE 法测定CaM 活性及定量测定CaM 的酶反应分两步进行：第 一步为依赖 CaM 激活的PDE将CAMP 转化为5-AMP；第二步是所加蛇毒中的5-核苷酸酶将 5-AMP 分解生成腺嘌呤并释放无机磷，故通过测定无机磷的含量即可得知CaM 对PDE 的激活 活性，再与标准曲线比较即可确定CaM 的数量。 1.仪器设备 活动冷室、高速冷冻离心机、高速组织捣碎机、输液泵、部分收集器、恒温