蛋白质印迹免疫印迹课件.pptVIP

NC膜 滤纸 滤纸 SDS滤纸 滤纸 ＋ － SDSNC膜 实 验 操 作 第三部分 酶标免疫反应显示Immuno-detection of Protein Blots with HRP-labeled Antibody 1. 蛋白转移膜的丽春红染色显示： （使用预染Marker此步骤可省略） 转移电泳完毕，断电，取出转移夹，取出转印膜于20ml蒸馏水中漂洗一遍，然后用10ml丽春红染液（0.2%丽春红-1%乙酸）染1min；用蒸馏水漂洗至背景近白色，漂洗应少量多次，每次30ml左右；照相留底；继续用蒸馏水漂洗至色带消失或者基本消失。 实 验 一 蛋白质印迹/免疫印迹 Western blotting/Immunoblotting 基本操作流程 提取组织或细胞蛋白，蛋白含量测定 制备SDS凝胶 蛋白质变性，电泳分离蛋白质 电泳转膜 封闭，加一抗 清洗，加二 抗 清洗，底物显色（曝 光） 结果分析 实验时间安排 1. SDS胶制备 2. 样品蛋白质含量测定 3. 电泳 4. 提取小鼠基因组DNA 1. 转移电泳 2. 蛋白质胶考马斯亮蓝染色分析 3. 膜封闭 4. 加一抗（过夜温浴4℃） 1. 洗膜、考马斯亮蓝染色胶脱色 2. 加酶标二抗（温浴37 ℃ ，1h） 3.洗膜与显示 4.结果分析 第一天 第二天 第三天 实 验 原 理 第一部分： 1. SDS（polyacrylamide gel electrophoresis ） CH2 CH C NH2 O CH2 CH C NH O CH2 CH2 CH C NH O Acrylamide N,N-Methylene Bisacrylamide [CH2 CH]n C NH2 O CH2 CH C NH O CH2 CH2 CH C NH O [CH2 CH]n C NH2 O [CH2 CH]n C NH2 O [CH2 CH]n C NH2 O [CH2 CH2 CH C NH O CH2 C NH O CH2 CH polyacrylamide 实 验 原 理 SDS浓度与分离蛋白质范围 丙烯酰胺浓度（％） 线性分离范围（kD） 15 10~43 12 12~60 10 20~80 7.5 36~94 5.0 57~212 实 验 原 理 实 验 原 理 第一部分：SDS电泳 2、蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同蛋白在不同pH下表现出不同的电荷；为使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，上样前应进行处理，即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上样缓冲液。经高温处理，使SDS 与蛋白质充分结合，蛋白质完全变性和解聚，形成棒状结构，同时使整个蛋白带上负电荷，电泳时凝胶中所含的SDS负电荷多肽复合物向正极泳动。 实 验 原 理 第一部分：SDS电泳 3. 蛋白样品处于 pH6.8 压缩胶的上层，pH8.8 的分离胶层在下层。由于pH不连续和胶孔径大小不连续，在浓缩胶泳动时，Pro-受阻小，在慢离子（Gly-）和快离子（Cl-）的共同作用下，不同蛋白质可在压缩胶上被压缩成一薄层，使全部蛋白质在进入分离胶前位于同一“起跑线”上；当蛋白质进入分离胶时 ，不同蛋白以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异， 最终达到彼此分开 。 实 验 原 理 第二部分：样品的印迹（转膜） 1. 选择适当的膜并进行预处理： NC膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1×转移缓冲液浸泡，使NC膜得到彻底浸润，一般5 分钟以上。 PVDF 膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约 1-2 分钟。 膜的选择 PVDF膜 硝酸纤 维素膜 0.45um和0.2u