DB32-T 3762.10-2020新型冠状病毒检测技术规范 第10部分：微量血清中和试验.docxVIP

DB32/T 3762.10—2020 PAGE I 新型冠状病毒检测技术规范 第10部分：微量血清中和试验 范围 本部分规定了新型冠状病毒微量血清中和试验环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、操作步骤、结果判定和清场与消毒。 本部分适用于新型冠状病毒实验室微量血清中和试验。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 微量血清中和试验 serum microneutralization test 将病原体及其产物（毒素）与免疫血清相混合，在体内或体外检测其致病力的试验，用以检查动物的免疫状态，测定抗原滴度，以及病原鉴定等。 细胞病变效应 cytopathic effect，CPE 病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。大多数病毒感染敏感细胞培养都能引起其显微镜下表现的改变，如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为多核细胞，细胞内出现包涵体，乃至细胞裂解等。 半数组织培养感染剂量 median tissue culture infective dose (TCID50) 能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡所需的病毒量，用以表征病毒的滴度。 环境与设施 实验室资质及级别要求 应符合《新型冠状病毒实验室生物安全指南》的要求，病毒培养包括病毒的分离、培养、滴定、中和试验等实验操作应当在生物安全三级实验室（BSL-3）的生物安全柜内进行。实验室开展相关活动前，应当报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资质。 操作人员资质及防护要求 实验操作人员应经过生物安全培训并取得BSL-3实验活动上岗证，在身体健康状态良好的情况下经实验室主任批准后方可开展活动。操作人员应根据《新型冠状病毒实验室生物安全指南》要求，按照BSL-3个人防护的要求进行防护。 设备与耗材 设备 生物安全柜、离心机、倒置显微镜、涡旋器、冰箱、CO2培养箱等。 耗材 N95及以上防护口罩、医用无纺布帽、护目镜、连体防护服、一次性PE手套、一次性手术衣、乳胶手套、防水靴套、微量移液器及各种配套带滤芯Tip头、一次性平皿、离心管、96孔细胞培养板等。 试剂与材料 试剂 Hanks溶液（每毫升含青霉素、链霉素各2000单位） DMEM培养液（含10%胎牛血清）。 DMEM维持液（含2%胎牛血清）。 消化液 （0.25%胰酶和0.025% EDTA-Na2混合液）。 材料 已滴定的新型冠状病毒悬液。 阳性对照血清、阴性对照血清（正常血清）及待检血清。 非洲绿猴肾传代细胞（VERO-E6）、人呼吸道上皮细胞、人肝癌细胞（Huh7）或其它敏感细胞。 试验技术要点 确定实验室质量控制标准的新型冠状病毒病毒株滴度，应至少有三次独立的滴度水平测定结果，三次实验结果的滴度波动不应超过+/-0.5。 中和抗体滴度的判定是以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，因此设置对照实验十分重要。 采用固定病毒—稀释血清的方法进行微量中和试验。 操作步骤 实验前准备 将实验所需细胞置37℃ 5% CO2培养箱培养至单层，在进入BSL-3接种病毒前，弃掉细胞培养液，用Hanks溶液洗3次。 配备消毒液：75%乙醇、有效氯5500 mg/L的含氯消毒液。 将细胞、病毒、血清、试剂和耗材一次性带入BSL-3核心区。 血清稀释 血清的处理：将待测血清、阳性对照血清及阴性对照血清56 ℃水浴灭活 30 min，为防止管盖崩开，要用封口膜封管口。待冷却后移至生物安全柜内进行稀释。 在生物安全柜里，将待测血清、阳性对照血清及阴性对照血清用DMEM维持液做倍比稀释，使其稀释度分别为1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128，每管量为0.5 ml。每一稀释度必须更换吸头，吹打混匀。 病毒稀释 在生物安全柜里，用DMEM维持液稀释病毒至100TCID50/0.1ml。 血清与病毒结合 在上述各稀释的血清管内加0.5 ml病毒稀释液（100TCID50/0.1ml ），充分混匀，拧紧管盖，用封口膜封口后置37℃水浴1 h。 病毒对照为0.5 ml病毒稀释液（100TCID50/0.1ml ）加0.5 ml的维持液，同样用封口膜封口后置37℃水浴1 h。 正常细胞对照不加病毒，仅含DMEM维持液。 接种细胞 弃去细胞培养孔中的Hanks液。 将每个稀释度的血清病毒混合物接种到单层细胞上，每一稀释度接种4孔，每孔0.2 ml。 将接种好样品的96孔培养板置37℃ 5% CO2培养箱中培养。 结果观察 每24 h在倒置显微镜下观察细胞