兽医微生物学课件-免疫标记技术.pptVIP

1.抗原(或抗体)包被： 包被的蛋白质浓度通常为1～10ug/ml，应通过实验选择，最适浓度按所需浓度溶于包被液 (PH9.6，0.05molNa2CO3缓冲液)加入聚苯乙烯滴定板的平底小孔内，4℃过夜，用含助溶剂吐温20(0.05%)的PBS洗涤3次。 2.吸附： 先加入与包被抗体 (或抗原)相对应的被检物，吸附后充分洗涤，再加入与被检物对应的抗抗体 (或其他对应物)，再洗涤，这样可以多层次的叠加，但最后一层必须连接酶，以便与底物作用显色，吸附试验的方法主要有以下几种。 (1)间接法：用于测定抗体。先将抗原被覆，洗涤后加待检血清，充分漂洗后加入酶标记的抗抗体，洗后即可供显色观察。 (2)夹心法：先用抗体(IgG)被覆，加待检抗原，作用洗涤后，加酶标记抗体。 (3)竞争法：用抗体被覆，加一定量的标记抗原和待检抗原混合物，二者竞争与板上的抗体结合，显色后与加未标记抗原的对照组比较，试验孔颜色显著低于对照孔者为阳性孔，待检抗原含量越高，颜色越浅，此法适于小分子抗原或半抗原的检测。 （4）双夹心法，先将抗体被覆，第二层是待检抗原，洗后加酶标记抗抗体。但第三层抗体必须不同于用于被覆的抗体，以避免假阳性。本法适于检查大分子抗原。 特异性相同，来源不同 (5)酶抗酶抗体法： 将抗原吸附于载体上，然后加待检抗血清，第三层加抗抗体，第四层是抗酶抗体，第五层是酶。其中第二层的抗血清与第四层抗酶抗体必须是同一制备的。这样就可以利用抗抗体搭桥，它的二只手，一手拉住待检抗体，一手拉住抗酶抗体。此法不需事先标记酶，且可事先准备好酶-抗酶抗体复合物，为其优点。 3.底物显色：与免疫酶组化染色法不同，必须用反应后能形成水溶溶性色素的供氢体，常用的有邻苯二胺 (CPD)，联苯茴香胺，5-氨基水杨酸和邻联甲苯胺 。于用前配制避光保存，加入反应孔作用20～30min，反应结束，加浓硫酸或浓碱液中止反应。 4.结果判定 在白色背景上，用肉眼观察，每批试验均需有阴性对照。颜色反应明显深于对照组者判为阳性。亦可用分光光度计测定，待检孔OD值 (P)与对照孔OD值(N)的比值 (P/N)大于1.5或2.0者为阳性。 三、放射免疫测定 将抗原抗体反应的特异性与同位素测定技术的敏感性相结合的一项新技术，具有特异性强、灵敏度高、准确性和精密度好等优点。而且操作简便、易于标准化，其灵敏度可达10－9—10－12g水平，是其他分析方法所无法比拟的。 RIA常用的同位素是8H和125I和3H。3H标记需要在特殊装置中进行，因其半衰期很长，故多由放化试剂中心标记后做成试剂盒供应。125I半衰期60天，可用氯胺T法将其连接于酪胺残基的芳香环上，形成碘化结合物。本法主要用于激素等活性物质的超微量分析，常用的有液相法和固相法2种。 1、竞争法： 系利用标记抗原和待检抗原竞争结合原理，先按一定量标记抗原 (Ag*)和待测抗原 (Ag)混合，然后加入抗血清 (Ab)，孵育一定时间，使反应达到平衡，即形成结合型的标记抗原Ag*-Ab(B)和游离型标记抗原Ag*(F)。 (一)液相放射免疫测定 抗原抗体反应是一种可逆反应，反应稳定时，标记的游离抗原 (F)和标记的结合抗原 (B)鞍平衡系数K呈一定比例。如在上述反应中加入未标记的抗原，则由于抗原的竞争性吸附，F值增加，B相应减少。B%的减少与末标记抗原的量相关，如以已知递增的抗原量为横座标，B%为纵座标，可画制出标准曲线。 免疫标记技术 标记抗体技术是在抗体球蛋白分子上，连接某一个特定的、容易检测的分子或原子 (标记物)，利用标记抗体能与相应抗原结合的特性，通过标记物的检测，从而确定抗原的存在部位。标记抗体技术目前广泛应用的主要有荧光抗体、酶标记抗体和同位素标记抗体等。前二者主要用于抗原定位，而后者不仅可用于定性、定量，还可用于定位。此外尚有铁蛋白标记抗体，主要用于免疫电镜的技术，在亚细胞水平上进行抗原定位。 一、荧光抗体技术 (Fluorescent antibody technique) 将荧光染料连接在提纯的抗体球蛋白分子上，这种用荧光染料标记的抗体，就叫荧光抗体。一种物质受到短波光线 (如紫外线、蓝紫光)激发后，能放出波长比激发光长的可见光，此种光称为荧光染料，抗体经过荧光染料标记后，并不影响其与抗原结合的能力和特异性。因此，当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出。 (一)直接法 将提纯的抗体球蛋白(主要为IgG)与FITC结合制成荧光抗体。 炭疽杆菌24h培养物直接荧光抗体检测 1、制片： 待检病理组织做成冰冻切片或触片，细菌材料可做成涂片，在室温中自然干燥，