加味补阳还五汤对糖尿病大鼠视网膜微血管周细胞凋亡的影响.docxVIP

加味补阳还五汤对糖尿病大鼠视网膜微血管周细胞凋亡的影响 糖尿病性视网膜病变是糖尿病最常见的微血管并发症之一。周细胞失血管的形成是早期dri的主要病理改变。研究表明, 周细胞丧失为DR的促发因素 1 材料表面 1.1 细胞剂 健康雄性清洁级SD大鼠, 鼠龄6周, 体重 (200±20) g, 上海斯莱克实验动物有限责任公司提供, 许可证号:SCXK (沪) 2007-0005。 1.2 药剂、菌株、培养基 链脲佐菌素 (Streptozotoci STZ, 美国Sigma公司) ;加味补阳还五汤 (生黄芪15 g、山药15 g、苍术9 g、桃仁5 g、红花5 g、当归9 g、川芎6 g、赤芍10 g、茯苓15 g、生地15 g、玄参15 g, 水煎至50 m L备用, 福建中医药大学附属人民医院药剂科) ;羟苯磺酸钙 (西安利君制药股份公司) ;胰蛋白酶 (1∶250, 美国Amresco公司) ;比色法TUNEL试剂盒 (美国Promega公司) 。 2 方法 2.1 dm诱导成功 采用SD大鼠80只, 20只分为正常组, 余下60只行DM造模。适应性喂养1周, 禁食12 h后, 以STZ 60 mg/kg一次性腹腔注射诱发大鼠DM。STZ临用前以0.1 mmol/L、pH4.5柠檬酸缓冲液溶解, 配置成1%溶液。于腹腔注射前及腹腔注射后72 h取尾血检测血糖, 血糖浓度≥16.7 mol/L即为DM诱发成功。造模成功后随机分为治疗组、对照组、空白组, 每组各20只。以后每周测1次血糖, 同时观察大鼠一般状况。 2.2 灌胃液及对照组方法 治疗组采用加味补阳还五汤, 灌胃, 按方剂饮片合剂量10.71 g/ (kg·d) 计算, 取原药煎液1.35m L, 加蒸馏水稀释至3 m L, 一次性灌胃, 每日1次。对照组采用羟苯磺酸钙120 mg/ (kg·d) , 蒸馏水稀释至3 m L, 一次性灌胃, 每日1次。空白组给予生理盐水3 m L/d, 每日1次。各组用药12周。正常组行常规喂养。 2.3 视网膜的剪截 麻醉后脱椎处死大鼠, 摘除眼球。玻璃体腔注射4%多聚甲醛0.2 m L后, 将眼球置于4%多聚甲醛中, 4℃固定72 h后取出眼球, 流水轻轻冲洗5 min, 从睫状体处环形剪开眼球, 去除眼前节和玻璃体。将余下的眼杯置入蒸馏水中, 轻轻剥离视网膜, 以视盘为中心将网膜橘瓣样剪成3块, 0.01mol/L、PH7.4的PBS漂洗10 min, 0.15 mol/L、PH7.4的甘氨酸缓冲液浸泡过夜, 3%胰蛋白酶 (临用现配) 37℃消化2~3 h。终止消化, 将视网膜吸入蒸馏水中漂洗轻轻吹打, 至仅剩下一层透明的视网膜血管网。漂取血管网并带水平铺展开于载玻片上, 自然干燥, 4℃保存备用。 2.4 iff法染色 蒸馏水中浸洗视网膜消化铺片5 min;1%高碘酸水溶液氧化5 min;schiff试剂室温染色15 min;亚硫酸冲洗液换洗3次, 每次2 min;流水清洗10 min;蒸馏水浸泡5 min;Mayer苏木精复染细胞核2 min;流水冲洗5 min;蒸馏水浸泡5 min;逐级酒精脱水;二甲苯透明;树胶封片。 2.5 死亡检测 采用TUNEL法检测原位细胞凋亡, 检测步骤按Promega公司比色法TUNEL试剂盒说明书进行操作。 2.6 资料来源及周细胞凋亡 观察不同倍数下PAS染色的视网膜血管消化铺片, 观察微血管及周细胞形态特点, 随机选择铺片中视网膜后极部5个不含小动脉、小静脉的高倍 (×400) 视野, 统计单位视野内周细胞数量, 采用Image Pro Plus 6.0分析单位视野内微血管网的面积率 (微血管网面积/单位视野面积) 。观察TUNEL染色片, 自视盘往前统计周细胞凋亡数目。如整个铺片上未见周细胞凋亡, 为“无”, 记为“-”;如有视野可见1个周细胞凋亡, 为轻度, 记为“+”;如有视野可见2个周细胞凋亡, 为中度, 记为“++”;如有视野可见3个甚至3个以上周细胞凋亡, 为重度, 记为“+++”。 2.7 早期涂膜形貌 PAS染色:细胞变小, 核浓缩, 核破碎, 早期细胞膜相对完整, 晚期形成由细胞膜包绕的“凋亡小体”。TUNEL染色:阳性者细胞核深染。 2.8 统计学分析 用SPSS 11.5进行数据处理, 计量资料正态分布者的比较采用单因素方差分析, 两组间的比较采用最小显著差 (LSD) 法, 计量资料偏态分布者转换成等级资料及计数资料的比较采用秩和检验Kruskal Wallis法或Nemenyi法。P0.05为差异具有统计学意义。 3 结果 3.1 视网膜微血管周细胞 治疗组、对照组、空白组的视网膜微血管形态与正常组无明显差异, 微血管排列规则, 毛细血管管径粗细均匀, 见图