奶油栓孔菌子实体多糖的化学性质及酒精性肝损伤的保护作用.docxVIP

奶油栓孔菌子实体多糖的化学性质及酒精性肝损伤的保护作用 酒精性肝病（ald）是由长期饮酒引起的肝脏损伤性疾病，包括从脂肪变质到肝硬化的广泛肝脏病变。 奶油栓孔菌Trametes lactinea是隶属于担子菌门Basidiomycota、伞菌纲Agaricomycetes、多孔菌目Polyporales、多孔菌科Polyporaceae、栓孔菌属Trametes的一种大型真菌，其子实体一年生，硬木栓质至木栓质，是我国热带地区一种常见的大型真菌（ 1 材料和方法 1.1 材料、试剂和机器 1.1.1 tratelact三维培养 奶油栓孔菌子实体采自福建省南平市浦城仙芝楼灵芝基地，经鉴定为奶油栓孔菌Trametes lactinea；昆明种小鼠40只，由吴氏实验动物在线提供（/xieli/），体重18–22g，雄性。 1.1.2 试剂和试剂盒 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）和抗坏血酸（VC）均为国产分析纯；联苯双酯滴丸由北京协和药厂提供；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；苏木素-伊红染液试剂盒由江苏凯基生物技术股份有限公司提供；UV-vis 1800紫外可见分光光度计（岛津实验器材有限公司）；Varioskan Flash多功能酶标仪（美国Thermo公司）；Nicolet i S 50傅立叶变换红外光谱仪（美国Thermo公司）；BX43生物正置显微镜（日本Olympus公司）。 1.2 方法 1.2.1 分离纯化蛋白质 将奶油栓孔菌子实体烘干后粉碎，取适量子实体粉末按料液比1:30加入去离子水，置90℃水浴锅中提取4h，重复提取2次，合并两次提取液，加入3倍体积的无水乙醇，于4℃冰箱中静置过夜，离心收集沉淀，用去离子水复溶，用Sevage试剂（氯仿:正丁醇=4:1）进行脱蛋白质直至无沉淀，离心取上清液。将多糖溶液装入透析袋中连续流水透析48h，除去小分子物质，将透析后的多糖溶液冻干，得到奶油栓孔菌子实体多糖（TLFPS）。 1.2.2 化学组成分析 总糖含量采用苯酚-硫酸法（ 1.2.3 紫外吸收光谱测定 多糖样品配制成0.25mg/mL的溶液，利用紫外-可见分光光度计在190–300nm范围内扫描，扫描间距为1nm。 1.2.5 刚果红试验 参考 1.2.6 活性测定 DPPH自由基清除活性测定：参考 A ABTS自由基清除活性测定：参考 A 超氧阴离子自由基清除活性测定：超氧阴离子自由基清除能力测定参照 A 铁离子还原能力测定：参照 1.2.7 小鼠肝功能指标的测定 动物分组和处理：将购买的40只雄性小鼠随机分成4组，每组10只，分别为空白组、模型组、多糖组（200mg/kg TLFPS）和阳性对照组（300mg/kg联苯双酯）。适应性喂养一周后，对照组和模型组小鼠灌喂蒸馏水，多糖组和阳性对照组小鼠按对应剂量灌喂给药8d，期间自由进食。参照 小鼠的醉酒与醒酒时间测定：参考 小鼠肝指数及其血清ALT、AST、TC、TG指标的测定：解剖前称量体重，解剖后称量肝脏总重，小鼠肝指数=肝脏总重/体重×100%，从小鼠眼球部位取血，经3 500r/min离心后取上层血清备用，根据试剂盒说明书要求测定血清ALT、AST、TC、TG的水平。 肝脏MDA、CAT、SOD指标的测定：称取小鼠肝组织制成10%的匀浆液，5 000r/min离心，取上清液备用，根据MDA、CAT、SOD试剂盒说明书要求分别测定MDA、CAT、SOD的水平。 肝组织病理学观察：取各组肝左叶中部切片用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片、苏木素-伊红染液试剂盒染色后，在200倍显微镜下进行观察并拍照。 1.3 数据的统计与分析 数值用uf060x±s表示，数据分析采用SPSS20.0软件，P0.05和P0.01表示显著差异和极显著差异。 2 结果与分析 2.1 tlfps的化学成分分析 比色法测定结果显示多糖含有较高糖醛酸含量和硫酸根含量，并且结合有微量蛋白质（表1）。 2.2 tlfps多糖类物质 紫外-可见光谱扫描结果见图1，在195nm处有明显吸收峰，这是多糖的特征吸收峰，表明TLFPS属于多糖类物质。在280nm波长附近有微弱吸收峰，表明经脱蛋白处理后，仍有少量蛋白与多糖紧密结合（ 2.3 tlfps红外光谱分析 红外光谱分析结果显示，在3 412.00cm 2.4 tlfps三螺旋结构分析 刚果红能与具有三股螺旋构象的多糖形成络合物，与不加多糖的刚果红溶液相比最大吸收波长（λ 2.5 dpp