六味地黄苷糖片多糖部位相对分子质量与组成分析.docxVIP

? ? 六味地黄苷糖片多糖部位相对分子质量与组成分析 ? ? 郝晓娟， 付 娟， 胡军华， 王振中， 肖 伟1，* (1.南京中医药大学，江苏 南京 210000；2.中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001；3.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001) 六味地黄方由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻组成，始见于《小儿药证直诀》，由宋朝名医钱乙首创，是中医滋补肾阴的经典名方[1]。六味地黄苷糖片是在六味地黄汤的基础上，结合现代药理学、药效学活性评价，经两次醇沉、两步层析提取分离，由水溶性多糖、以甘露三糖为主的寡糖，以莫诺苷、马钱苷、芍药苷为主的糖苷类组成的创新中药，其中多糖部位主要表现为免疫促进作用[2]。 多糖是一类由多羟基醛或多羟基酮及其衍生物、聚合物的总称，为中药中主要药效物质基础之一[3]，其分子量大，结构复杂，生物活性有明显差异，近年来越来越受到关注。由于该成分生物活性、分子量与其分布和组成密切相关，故2015年版《中国药典》已将相对分子质量及其分布列入该成分质量标准中[4-5]。 本实验以六味地黄苷糖片中多糖部位为研究对象，对其相对分子质量及组成进行初步考察，不仅为进一步研究该部位生物活性与其一级结构的关系提供基础，又为提升该制剂质量标准提供依据。 1 材料 AL204、MS-105DU电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；HH-8数显恒温水浴锅(金坛市康华电子仪器制造厂)；H1850R台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；LC-28AB高效液相色谱仪，配置RID-10A示差折光检测器(日本岛津公司)；KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；HGC-36A型氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；Agilent7890B-7698A气相色谱仪(美国安捷伦公司)；磷酸二氢钾为色谱纯，购自上海麦克林生化科技有限公司；三氟乙酸为色谱纯，购自美国天地公司；乙醇、丙酮、乙醚、吡啶、甲醇、硼氢化钠、三氯甲烷等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；正丙胺购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。各相对分子质量葡聚糖(T670、T410、T270、T110、T70、T40、T20、T5)购自美国Sigma-Aldrich公司、阿拉丁试剂(上海)有限公司；L-(+)-阿拉伯糖(批号WXBB0 276 V，纯度≥99%)、L-鼠李糖(批号WXBB5 979 V，纯度≥99%)均购自美国Sigma-Aldrich公司；D-无水葡萄糖(批号110833-201908，纯度99.9%)、D-木糖(批号111508-201605，纯度99.9%)、D-甘露糖(批号140651-201805，纯度99.9%)、肌醇(批号190077-201501，纯度99.6%)、半乳糖(批号100226-201807，纯度100%)、D-葡萄糖醛酸(批号140648-201804，纯度99.8%)、D-半乳糖醛酸(批号111646-201702，纯度95.1%)均购自中国食品药品检定研究院。 六味地黄苷糖片多糖部位(批号Z160601、Z171001、Z191001、Z191201、Z191202)，购自江苏康缘药业股份有限公司。 2 方法 2.1 分子量测定 2.1.1 色谱条件与系统适用性试验 TSK-GEL G4000PWXL、TSK-GEL G1000PW色谱柱(7.8 mm×300 mm)串联[6-8]；流动相0.02 mol/L KH2PO4溶液；体积流量0.5 mL/min；RID检测器；检测器、柱温箱温度40 ℃；进样量20 μL。 2.1.2 多糖部位前处理 Reference[9]报道。取多糖部位适量，60%乙醇洗涤，每次20 mL，涡流2 min后离心，重复以上操作至醇洗液呈无色(约洗涤16次)，转移至布氏漏斗中，分别用乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤，挥干，备用。 2.1.3 供试品溶液制备 精密称取“2.1.2”项下醇洗多糖2.5 g，置于烧瓶中，精密加入流动相100 mL，称定质量，100 ℃下回流提取1 h，放冷，加水补足减失的质量，摇匀，14 000 r/min离心5 min，取上清液，即得。 2.1.4 对照品溶液制备 精密称取不同相对分子质量的葡聚糖、D-无水葡萄糖对照品各50 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解后定容至刻度，摇匀，离心，即得。 2.1.5 方法学考察 2.1.5.1 线性关系考察 取“2.1.4”项下对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。采用GPC软件，以对照品重均分子量的对数(