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利用ssr标记检测大豆灰斑病抗性基因连锁 大豆的种植起源于中国。随着近年来中国大豆品种数量的增加，正确识别大豆品种的遗传特性尤为重要。近年来,随着分子生物学的不断发展,分子标记技术从DNA出发,不受环境条件的影响,多态性的标记可以反映DNA水平上生物个体间的遗传差异,因此可从分子水平上对品种的遗传特异性进行快速、准确的鉴定,克服了传统形态标记鉴定周期长、误差大、性状差异小的缺点。作为一种高多态性的分子标记,SSR越来越多地应用于各物种起源的分析 大豆灰斑病是由大豆尾孢菌(Cercospora sojina Hara)引起的真菌性病害,是世界上大豆生产国普遍存在的一种大豆病害,其致病菌具有非常明显的生理分化现象和高度变异性。大豆对灰斑病菌生理小种的抗性是单基因控制的显性性状,美国已经鉴定出3个显性基因Rcs1、Rcs2和Rcs3,分别控制大豆对美国灰斑病菌生理小种1号、2号和5号的抗性 分子身份证是在指纹图谱的基础上发展起来的一种新的电泳图谱,与指纹图谱的区别在于分子身份证把品种特征数字化后,采用资源特征分析软件分析得出字符串形式的结果,这种结果可以简单明确地区分品种间的差异。分子身份证既能够鉴别生物个体之间的差异,又能对生物个体的特征进行鉴定,易于存档记录和分析比较。分子身份证的研究多应用在资源的遗传多样性分析中,但还没有用于对大豆抗病特征的相关研究。本文对大豆20个连锁群上与灰斑病抗病基因连锁的26个SSR标记进行筛选,最终选用与大豆灰斑病抗病基因连锁的7个SSR标记对103份大豆品种(系)(已鉴定对大豆灰斑病菌3个生理小种抗性)进行扩增,通过遗传聚类分析和等位基因计算,最后构建了大豆品种(系)分子身份证。该研究可以很好地了解品种(系)间遗传差异,为品种(系)的合理搭配种植、杂交育种的亲本选配提供重要参考依据。建立不同大豆灰斑病生理小种抗性品种(系)的分子身份证,为科学鉴定、培育新的抗病品种(系)提供参考依据。 1 材料和方法 1.1 病性及病理性 103份大豆品种(系)来源于黑龙江省29个大豆育种单位,采用单个小种接种,鉴定其对中国大豆灰斑病菌1号小种、15号小种和美国大豆灰斑病菌5号小种的抗病性(表3)。对中国大豆灰斑病菌1号小种抗病和感病的品种(系)分别为45份和58份,对中国大豆灰斑病菌15号小种抗病和感病的品种(系)分别为57份和46份,对美国大豆灰斑病菌5号小种抗病和感病的品种(系)分别为47份和56份。中国1号小种抗病对照品种(系)为垦丰16,感病对照品种(系)为黑河05-1667;中国15号小种和美国5号小种抗病对照品种(系)为垦丰16,感病对照品种(系)为绥农10。鉴定单位为黑龙江省农业科学院佳木斯分院植物病理研究室。 1.2 提取dna和ssr标记 采用SDS法提取叶片总DNA。PCR体系20μL,含30 ng总DNA,1.5μmol L 1.3 电泳知识的应用 根据扩增片段的大小(图1),对应的分子量从大到小从阿拉伯数字的1开始记录,依次为1、2、3、4、……、n,统计数据。0表示零等位基因(即该泳道由于基因片段丢失而无带),-1表示该品种(系)数据由于实验操作造成缺失,-2表示该泳道出现杂合带型。运用统计学原理进行分析计算。 采用东北农业大学开发的遗传统计分析软件(Genetics Statistics 3.0)分析品种(系)特异性指数、引物多样性指数和多态信息含量。利用东北农业大学开发的资源特征分析软件ID Analysis 1.0 2 结果与分析 2.1 pcr扩增检测 筛选出的19对扩增稳定、多态性高的标记引物能对所有品种(系)进行PCR扩增(表1)。这些标记分布在大豆的J、C、O、G、I、C1和B1连锁群上。 2.2 标记多样性分析 103份品种(系)中,检测到多态性片段86个,每个标记检测到的等位基因数目在2~6个之间,平均为4.4个(表2)。其中等位基因数大于平均数的标记为Satt547、Satt431、Satt303、SOYGPATR、Satt565、Sct_186、Sat_224和Satt244。应用遗传统计软件分析表明,标记的多样性指数介于0.198~0.751之间,平均多样性指数为0.606,其中Satt244多样性指数最高,表明它区分品种(系)的能力最强。多样性指数大于平均数的标记为Satt547、Satt529、SOYGPATR、Satt565、Sct_186、Sat_224、Satt244、Satt119、Satt239和Satt543。在这两类指数大于平均数的标记中,共同出现的标记有6个,标记的等位变异数越多,其多样性指数就越高。说明标记的等位变异数和引物的多样性指数在总体上是一致的。图2为标记Sat_151的引物对部分大豆品种(系)的扩增结果,共有4个等位基因。 2.3